Диагностическая техника: ООО ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА — ОГРН 1147847395013, ИНН 7841511060

Современная медицинская диагностическая аппаратура

фото с сайта incart.ru

Медицинское диагностическое оборудование создает необходимую информационную основу для выбора эффективных методов лечения и во многом определяет качество и своевременность медицинской помощи.

Современная медицина имеет в своем арсенале широкий диапазон инструментов, позволяющих активно вмешиваться в работу органов и систем организма человека. Большие возможности неотделимы от высокой ответственности. Назначенное лечение должно быть полностью адекватным состоянию пациента, соответствовать индивидуальным факторам риска, возрастным и другим специфическим особенностям конкретного организма. Соблюдение всех этих условий невозможно без применения химических и инструментальных средств лабораторной, функциональной, лучевой, эндоскопической диагностики.

Без применения специального оборудования не обходится ни один курс лечения. Диагностика – первый и самый ответственный этап процесса восстановления здоровья человека. От его достоверности и точности во многом зависит целесообразность и эффективность всех последующих действий: назначения медикаментозной терапии, физиотерапевтического или хирургического лечения.

Развитие многих серьезных патологий можно замедлить, если выявить их на ранней стадии. Современная диагностическая техника успешно решает эту задачу. Профилактические медицинские осмотры с применением эндоскопической аппаратуры, инструментов лабораторной и оборудования для функциональной диагностики позволяют обнаружить малейшие отклонения в физиологических процессах и своевременно внести коррективы. Такой подход  к лечению «болезней века» — сердечно-сосудистых, онкологических, неврологических – способствует замедлению патологических процессов и существенному повышению качества и продолжительности жизни пациентов.

Медицинскому диагностическому оборудованию всегда уделяется особое внимание на медицинских выставках. Приборы этого класса являются самыми востребованными в клиниках разного профиля. Производители медтехники ежегодно предлагают новые модификации инструментов для диагностики. Благодаря их усилиям аппаратура становится точнее, быстрее и надёжнее. Обновление диагностической аппаратуры – обязательное условие эффективного функционирования и развития любого лечебно-профилактического учреждения.

Особенно велико значение качественного оборудования для диагностических центров, чья основная специализация – верное обследование пациентов и создание максимально корректной диагностической картины. Многие пациенты в ходе лечения получают направление в специализированный центр или лабораторию для уточнения диагноза, поэтому качество технического оснащения подобных учреждений должно быть самым высоким.

Актуальное направление развития диагностического оборудования – разработка инструментов быстрого обследования, которые могут применять люди без медицинского образования. Портативные устройства используются волонтерами или в домашних условиях для правильного оказания первичной помощи заболевшему человеку.

В настоящее время ведутся разработки устройств, в основу работы которых заложены новейшие медицинские технологии. К ним относятся ДНК анализаторы, универсальные спектрографы, инструменты для проведения комплексных функциональных исследований.

Качественное диагностическое оборудование – ключевое условие результативной работы лечебных учреждений, эффективного лечения пациентов, хорошей репутации и доверия к медицинскому персоналу. При выборе компьютерных томографов, УЗ-сканеров, электрокардиографов, лабораторных анализаторов и другой аппаратуры целесообразно выбирать надежную продукцию известных на рынке производителей, предоставляющих своим покупателям гарантии и постоянную сервисную поддержку.

Департамент здравоохранения Москвы — Белые пятна медицинского обеспечения хотят ликвидировать, используя лечебно-диагностические комплексы

Этим летом на дорогах Троицкого и Новомосковского округов наблюдались новенькие светлые фуры с надписью «Лечебно-диагностический комплекс». В удаленных деревнях к ним выстраивались в очередь новые москвичи-сельчане — кому зуб удалить, кому флюорографию сделать, кому кровь сдать. Передвижные мини-поликлиники оказались как нельзя кстати. Вот только охватить всех желающих никак не успевали. Оказалось, что в медицинском обслуживании нуждаются не только жители деревень и сел — в городских поселениях квалифицированная медпомощь тоже в остром дефиците. Тогда на помощь пришли немецкие технологии: поликлиники экстренного обслуживания стали расти как на дрожжах. Испытывать их на прочность в российских условиях будут жители Крекшина, Рязановского и Первомайского.

В Новой Москве много поселков и улиц со старыми революционными названиями — здесь все еще поминают знамя октября, первое мая и прочие социалистические ценности. Зато по части социального обслуживания в большинстве населенных пунктов новомосковской земли дела обстоят не так гладко. Постоянные очереди, обветшавшие здания, недостаток врачей и современной техники — словом, отсталость, бедность и запустение. Решать все эти проблемы столичные власти начали поэтапно: закупили упомянутые уже передвижные лечебно-диагностические комплексы — лаборатории и поликлиники в одном флаконе, а также инициировали строительство быстровозводимых стационарных поликлиник. Технологию подобных медицинских сооружений нашли у рациональных и предусмотрительных немцев.

Модуль для оказания первичной медико-санитарной помощи представляет собой одноэтажное здание. Постройка собирается как конструктор: из кубиков складываются готовые медицинские кабинеты, просторные холлы и коридоры. Высота корпуса — 3,5 метра. Вся лечебная и диагностическая техника монтируется по ходу возведения здания. На все строительство уходит два-три месяца. Однако, несмотря на это, лечить здесь будут не хуже, чем в иных фундаментальных медицинских учреждениях, — все санитарно-гигиенические условия и противоэпидемиологические режимы соблюдены по самому высокому уровню. И персоналу будет где переодеться и отдохнуть — все продумано: есть служебно-бытовые и хозяйственные помещения. Конструкция стен и перегородок — многослойная, фасады модуля собираются из так называемых сэндвич-панелей, так что есть все основания предполагать, что в модульной поликлинике холодно не будет. Как в самой обычной амбулатории, здесь будут работать педиатрическое и терапевтическое отделения, отделение врачей-специалистов, молочно-раздаточный пункт.

На территории Троицкого и Новомосковского административных округов города Москвы будет построено четыре такие модульные поликлиники на 100–150 посещений в смену каждая. Открывать их будут прежде всего там, где отмечается дефицит стационарных медучреждений. Первая модульная поликлиника начнет работать в Крекшине — это детско-взрослая амбулатория на 100 посещений. Кроме этого идет строительство еще трех модульных поликлиник: в Рязановском поселении появится детская амбулатория на 150 посещений (поселок Знамя Октября) и детско-взрослая на 110 посещений (поселок Фабрика 1-го Мая), а в Первомайском — детско-взрослая амбулатория на 100 посещений. Еще один объект — это Марьинская амбулатория. Здесь в уже работающей поликлинике планируется надстроить второй, а возможно, и третий этажи. В новых амбулаториях будут осуществлять прием терапевты, педиатры, хирург-ортопед, гинеколог, невролог, кардиолог, офтальмолог, оториноларинголог.

Кроме быстровозводимых медицинских учреждений в течение ближайших лет на территории ТиНАО будут строиться и более долговечные объекты здравоохранения. В ближайшее время крупная поликлиника появится в Щербинке. В ней предусмотрены трамвпункт, диагностическое и стоматологическое отделения, женская консультация, а также койки дневного стационара. Крупный медицинский комплекс на 600 коек и перинатальный центр на 200 мест будут построены в Троицке. Кроме этого там откроется новая подстанция Скорой помощи с собственным дизель-генератором на случай перебоев с электричеством. Не за горами открытие новой поликлиники в Московском. Это будет учреждение на 400 посещений в смену — здание уже построено, завершается процесс лицензирования. На базе этой поликлиники откроется централизованная лаборатория, которая будет обслуживать все медорганизации ТиНАО. Если говорить о более долгосрочных планах, то в Московском намечено строительство подстанции Скорой помощи, в Кокошкине — детско-взрослой поликлиники, в Коммунарке — строительство двух поликлиник с женской консультацией и травмпунктом, родильный дом на 100 коек и реабилитационный центр на 200 коек. В Воскресенском запланировано строительство поликлиники на 300 посещений в смену, а в Воронове должны появиться подстанция Скорой помощи и детская амбулатория.

Параллельно с возведением новых объектов довольно активно ремонтируются и восстанавливаются старые медучреждения — идут кровельные работы, ремонтируются электросети, отопление, водоснабжение, проводится внутренняя отделка. И самое важное — отремонтированные здания комплектуются современным медицинским оборудованием. Например, в Щербинке уже начали работать офтальмологические комплексы, лор-установки, поступили дефибрилляторы, мобильный цифровой рентген-комплекс, аппараты ЭКГ, УЗИ, аппарат высокочастотной хирургии, современные стерилизаторы, многофункциональные кровати для стационара. Со дня на день ожидают цифровой маммограф и высокочастотный хирургический аппарат «Сургитрон».

Вместе с этим по дорогам ТиНАО продолжают колесить мобильные поликлиники — до конца года их закупят еще три, в том числе стоматологический комплекс, педиатрический лечебно-диагностический комплекс и комплекс рентгеновской компьютерной томографии. Таким образом, объезжать удаленные районы Новой Москвы продолжат пять поликлиник на колесах. Первые две с июля успели поработать в семнадцати поселениях, оказали более 30 тысяч медицинских услуг. Новых москвичей обследовали бригады специалистов в составе терапевта, хирурга, офтальмолога, отоларинголога, гинеколога, уролога, врачей УЗИ и функциональной диагностики, врача-лаборанта, врача-рентгенолога, медицинских сестер и фельдшера-лаборанта. Столичная помощь оказалась экстренно скорой!

Медучреждения Новой Москвы стремятся к столичным стандартам, отмечает руководитель дирекции по обеспечению деятельности учреждения здравоохранения на присоединенных территориях Сергей Яроцкий. Это значит, что в поликлиниках будут появляться информаты и терминалы записи к врачам, уже идет работа над единым сайтом. Записаться к специалисту или терапевту в скором времени можно будет, не выходя из дома. А еще в округе появятся кабинеты профилактики, где каждый желающий сможет с оказией проверить кровь на сахар, уровень холестерина, померить давление или получить рекомендацию по поводу прививок. И если «новый москвич» задумается о своем здоровье и примет решение обратиться к нужным специалистам, за медицинской помощью ходить далеко не понадобится.

http://www.mk.ru/nasha-moskva/article/2013/12/01/9…

Оборудование для функциональной диагностики Dixion

Измерительная (диагностическая) техника

Развитие электроники, научно-теоретические и практические достижения современной медицины, биохимии и фармации позволили запустить в массовое производство высокотехнологичные портативные измерительные диагностические приборы для индивидуального пользования.

Появление и  доступность медицинской измерительной диагностической техники предоставили возможность людям

• с хроническими сердечно-сосудистыми и эндокринными заболеваниями (тонометры, глюкометры, пульсометры и т.д.),
• с врождёнными или приобретёнными нарушениями веса ( весы, измерители жировых отложений, шагомеры и т. д.),
• профессиональным спортсменам и любителям (шагомеры, пульсометры и т.д.),


и всем тем, кто заботится о состоянии своего здоровья и ставит целью «работу на опережение», — заболевание всегда проще предупредить, чем потом лечиться годами, — проконтролировать состояние своего организма в данный конкретный момент времени.

Индивидуальная измерительная диагностическая техника может использоваться вне медицинского учреждения (дом, работа, прогулка на природе, ресторан, кинотеатр, клуб, путешествие и т.п.). На основе её показаний Вы сможете принять превентивные (предупреждающие) меры, которые могут воспрепятствовать возможному ухудшению состояния здоровья.

• Тонометры

  Люди, страдающие сердечно-сосудистыми заболеваниями, должны в обязательном порядке иметь дома этот прибор. Постоянный контроль своего кровяного давления может помочь пациенту страдающему гипертонией предотвратить два таких серьёзных и распространённых заболевания как инсульт и инфаркт миокарда
  Перейти к разделу

• Термометры

  В нашей аптеке представлены медицинские термометры, с их помощью измеряют температуру человеческого тела, и бытовые термометры — для измерения температуры воздуха или воды
  Перейти к разделу

• Глюкометры

  Портативные глюкометры для индивидуального использования создают предпосылки для «превращения» болезни сахарный диабет в определённый образ жизни, когда человек может чувствовать себя абсолютно полноценным, если не выходит за рамки некоторых, совсем незначительных, ограничений. Для людей здоровых и/или предрасположеных к сахарному диабету показано использовать глюкометры в профилактических целях
  
  Перейти к разделу

• Стетофонендоскопы

  Используются стетофонендоскопы для врачебной физикальной (физической, материальной, вещественной) диагностики. Иначе говоря, врач прослушивает звуки жизнедеятельности органов (например, наличие шумов в работе сердца или ритм его биения).
  Перейти к разделу

• Гигрометры

  Уровень влажности в помещении благоприятный для человека – это 40-60%. При более сухом воздухе у людей (особенно чувствительны дети) ухудшается самочувствие
  Перейти к разделу

Валерий Берман, путь от техника до врача

В рамках года медицинского работника, проводимого по инициативе губернатора Евгения Куйвашева, предлагаем познакомиться с врачом городской клинической больницы №14 Берманом Валерием Борисовичем.

50 лет лечит больных Валерий Берман, но не сразу он понял, что медицина – его призвание. Сначала учеба в Горно-металлургическом техникуме, потом служба в рядах Советской Армии диспетчером по перелетам бомбардировщиков дальней авиации. Но призвание побеждает. Еще в армии он начинает самостоятельно готовиться к экзаменам в медицинский институт и в 1971 году с отличием его оканчивает по специальности «Лечебное дело».

Свою трудовую деятельность еще с интернатуры молодой специалист начал в городской больнице №14 г. Свердловска, проработав и цеховым и участковым терапевтом и ординатором в стационаре.

Послужной список Валерия Бермана достаточно обширен, но начиная с 1980 года пройдя специализацию по гастроэнтерологии, его трудовая деятельность неразрывно стала с ней связана до сегодняшних дней.

«За время работы я был постоянно в поиске чего-то нового, что-то пытался внедрять в повседневную клиническую практику, какие-то новые формы и методы диагностики заболеваний органов пищеварения», — поделился с нами Валерий Берман.

Надо сказать, что у него это получалось, при его непосредственном участии начали проводить практически 100-процентные гистологические исследования при проведении фиброгастродуоденоскопии, фиброколоноскопии.

Он постоянно учится, повышает свою квалификацию, в том числе в школе гепатологов и в Московской академии им. Сеченова.

Глубокие профессиональные знания огромный опыт позволяют качественно выполнять свои обязанности.

«Работу с людьми, которые проходят ко мне на прием, я не оцениваю как обязанность, для меня это творческий процесс. Ведь расположить к себе больного, чтобы он доверительно рассказал о своих ощущениях, недомоганиях, проблемах, этому учишься всю жизнь. Мне, как врачу необходимо оценить клиническую картину, а тут работают глаза, уши, руки врача. КТ, УЗИ, лабораторные анализы – это уже потом, «нужно искать там, где нужно», — считает врач.

Валерий Берман, путь от техника до врача – Городская больница № 4 г.Н.Тагил

В рамках года медицинского работника, проводимого по инициативе губернатора Евгения Куйвашева, предлагаем познакомиться с врачом городской клинической больницы №14 Берманом Валерием Борисовичем.

50 лет лечит больных Валерий Берман, но не сразу он понял, что медицина – его призвание. Сначала учеба в Горно-металлургическом техникуме, потом служба в рядах Советской Армии диспетчером по перелетам бомбардировщиков дальней авиации. Но призвание побеждает. Еще в армии он начинает самостоятельно готовиться к экзаменам в медицинский институт и в 1971 году с отличием его оканчивает по специальности «Лечебное дело».

Свою трудовую деятельность еще с интернатуры молодой специалист начал в городской больнице №14 г. Свердловска, проработав и цеховым и участковым терапевтом и ординатором в стационаре.

Послужной список Валерия Бермана достаточно обширен, но начиная с 1980 года пройдя специализацию по гастроэнтерологии, его трудовая деятельность неразрывно стала с ней связана до сегодняшних дней.

«За время работы я был постоянно в поиске чего-то нового, что-то пытался внедрять в повседневную клиническую практику, какие-то новые формы и методы диагностики заболеваний органов пищеварения», — поделился с нами Валерий Берман.

Надо сказать, что у него это получалось, при его непосредственном участии начали проводить практически 100-процентные гистологические исследования при проведении фиброгастродуоденоскопии, фиброколоноскопии.

Он постоянно учится, повышает свою квалификацию, в том числе в школе гепатологов и в Московской академии им. Сеченова.

Глубокие профессиональные знания огромный опыт позволяют качественно выполнять свои обязанности.

«Работу с людьми, которые проходят ко мне на прием, я не оцениваю как обязанность, для меня это творческий процесс. Ведь расположить к себе больного, чтобы он доверительно рассказал о своих ощущениях, недомоганиях, проблемах, этому учишься всю жизнь. Мне, как врачу необходимо оценить клиническую картину, а тут работают глаза, уши, руки врача. КТ, УЗИ, лабораторные анализы – это уже потом, «нужно искать там, где нужно», — считает врач.

Выявлять рак и туберкулез в Приморье поможет мобильное диагностическое оборудование

30 октября 2019 11:00

Выявлять рак и туберкулез в Приморье поможет мобильное диагностическое оборудование

Два современных мобильных флюорографических комплекса на базе «ПАЗ» приобретены для краевого туберкулезного диспансера Приморья. Новая диагностическая техника представляет собой полноценный флюорографический кабинет с современным цифровым флюорографом, рабочим местом врача и зоной для пациента. Это первые диагностические комплексы-автобусы в Приморье, до сих пор врачи выезжали в отдаленные территории на «КАМАЗах».

Врио вице-губернатора – директор департамента здравоохранения Приморья Виктор Фисенко лично осмотрел мобильные комплексы и отметил, что новое оборудование способствует приближению медпомощи населению.

«Новые комплексы предназначены для проведения массовых рентгенологических обследований, а это значит, благодаря им жители смогут пройти обследование и получить профилактическую медицинскую помощь», – отметил куратор здравоохранения.

Виктор Фисенко подчеркнул, что комплекс будет регулярно выезжать в отдаленные населенные пункты, жителям которых проблематично добраться до районного центра.

«Ставка делается не только на выявление туберкулеза, но и на выявление онкологических заболеваний», – подчеркнул заместитель главы региона.

Главный врач краевой туберкулезной больницы Николай Сидоренко отметил, что уже составлен график выездов новых диагностических комплексов на территории.

«Мы планируем, что автобус будет выезжать для обследований несколько раз в неделю. За один такой выезд пройти диагностику смогут около 100 человек», – отметил он.

Новую технику оценили и врачи – те, кому предстоит работать на выезде.

«Техника хорошая, все продумано для работы врача и удобства пациента. Мы уже готовы к выезду. Опыт таких форм работ есть у всех врачей нашего диспансера. Все специалисты грамотные, нацеленные на выявление, в том числе и раковых заболеваний», – сказала врач-рентгенолог Анастасия Матвеева.

Напомним, что в Приморском крае сегодня реализуются региональные проекты, которые затрагивают все сферы жизни людей и соответствуют 11 национальным проектам, разработанным по Указу Президента РФ Владимира Путина.

Выявлять рак и туберкулез в Приморье поможет мобильное диагностическое оборудование. 30 октября 2019 года

«Борьба с онкологическими заболеваниями» – региональный проект нацпроекта «Здравоохранение». Его реализация позволит к 2024 году снизить смертность от новообразований и увеличить долю злокачественных новообразований, выявленных на ранних стадиях (I-II стадии) до 63%.

Ксения Гусенцова, [email protected]

Фото – Александр Сафронов (Администрация Приморского края)

Диагностические методы | Отделение патологии инфекционных болезней | DHCPP | NCEZID

IDPB использует различные диагностические методы при оценке образцов тканей, включая морфологические, антигенные и нуклеиновые кислоты. Эти тесты используются по мере необходимости на основе анализа данных случая и гистопатологии.

Иммуногистохимия (ИГХ)

IHC предлагает несколько явных преимуществ по сравнению с традиционными методами идентификации. Этот метод быстро расширяет диагностические возможности патолога.

IHC позволяет быстро идентифицировать агентов. В методе используются специфические антитела, которые локализуются к антигенам интересующего этиологического агента. Поскольку в этом методе используются ткани, фиксированные формалином, транспортировка образцов упрощается, что позволяет проводить ретроспективные исследования и сводить к минимуму воздействие инфекционных агентов на лабораторных работников.

IHC — это чувствительная и специфическая методология тестирования многих микроорганизмов, и в отличие от некоторых традиционных методов окрашивания, они дают прямые, хорошо интерпретируемые визуальные свидетельства присутствия инфекционного агента в тканях.Кроме того, IHC выявляет организмы, которые трудно культивировать, и те, которые нельзя культивировать.

IHC предоставляет бесценную информацию для клинической диагностики, а также для изучения патогенеза. IDPB разработала множество специальных тестов IHC для выявления новых или повторно возникающих инфекционных заболеваний. В настоящее время IDPB предлагает диагностические тесты IHC для более чем 100 этиологических агентов, включая вирусные, бактериальные, паразитарные и грибковые организмы. Для ряда агентов тесты IHC могут быть единственными надежными методами обнаружения.

Особые пятна

Специальные красители полезны для обнаружения бактерий, грибков и паразитов в тканях и культуральных материалах. Однако они могут не давать конкретного диагноза для организма, и каждое пятно отличается по уровню чувствительности.

Молекулярный

IDPB в настоящее время располагает набором тестов на основе ПЦР для обнаружения многих бактерий, вирусов, грибков и паразитов. Молекулярные тесты IDPB оптимизированы для фиксированных формалином и залитых парафином тканей.

Микробиология

В некоторых случаях необъяснимых заболеваний IDPB обладает ограниченными возможностями для вирусной культуры этиологических агентов. Этот метод зависит от свежезамороженных тканей или биологических жидкостей и позволяет проводить дополнительные исследования, такие как методы иммунофлуоресценции или электронная микроскопия.

Электронная микроскопия

Исследования с помощью электронной микроскопии (ЭМ) проводятся на культурах клеток, тканях и жидкостях организма. Доступны как тонкие срезы, так и отрицательные окрашенные ЭМ для помощи в диагностике и характеристике патогенов.ЭМ-исследование проводится на фиксированных глутаровым альдегидом тканях или жидкостях организма, фиксированных формалином блоках тканей, залитых парафином, подготовленных ЭМ-срезах, изображениях и сетках.

Диагностические методы для мониторинга и контроля фактического пламени

Реферат

Разработка диагностических методов, подходящих для мониторинга практического пламени, является важной задачей, которая привлекает все большее внимание и требует значительных исследовательских усилий. Это мотивировано необходимостью более точного описания процесса и, в конечном итоге, внедрения эффективных и надежных методов управления и оптимизации в качестве ключевого шага на пути к разработке более эффективных, гибких, надежных и чистых систем сжигания. Было предложено множество интересных попыток, включающих самые разные подходы с точки зрения используемых инструментов и концепций, предложенных для преобразования сенсорной информации в различные значимые параметры. В данной статье делается обзор методов, предлагаемых в литературе для мониторинга пламени, применяемых или задуманных для мониторинга практического оборудования для сжигания. Он разделен на четыре раздела, посвященных оптическим датчикам, методам визуализации, датчикам давления и методам зондирования.Подробный анализ опубликованных работ показывает, что, вероятно, основной проблемой в этой области является определение наиболее репрезентативных сигналов пламени и их последующая обработка для получения значимой информации, необходимой для диагностики состояния пламени или управления контроллером в эффективный и безопасный способ. Это вместе с широким спектром диагностических потребностей и ограничений, налагаемых различными ситуациями сгорания, вероятно, объясняет заметную неоднородность, наблюдаемую среди опубликованных работ. Несмотря на приложенные огромные усилия, методы, предлагаемые для расширенного мониторинга практического пламени, все еще находятся на стадии разработки. Однако в ближайшем будущем ожидается значительный прогресс в этой области, чему способствуют насущные потребности отрасли сжигания и непрерывный прогресс в сенсорной технологии, технологиях обработки сигналов и, что немаловажно, в понимании процессов горения.

Ключевые слова

Мониторинг пламени

Диагностика пламени

Контроль горения

Оптические датчики

Визуализация пламени

Колебания давления

Датчики газа

Датчики ионизации

Рекомендуемые статьи 2009 Elsevier Ltd.Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Методы молекулярной и иммунологической диагностики медицинских вирусов

Вирусные инфекции вызывают серьезные проблемы у населения во всем мире. Недавняя вспышка коронавирусного заболевания 2019 года, вызванная SARS-CoV-2, является прекрасным примером того, как вирусная инфекция может представлять большую угрозу для глобального общественного здравоохранения и секторов экономики. Поэтому первым шагом в борьбе с вирусными патогенами является своевременная и точная диагностика.Раннее и точное обнаружение вирусного присутствия в образце пациента имеет решающее значение для надлежащего лечения, контроля и предотвращения эпидемий. Здесь мы суммируем некоторые из молекулярных и иммунологических диагностических подходов, доступных для обнаружения вирусных инфекций человека. Методы молекулярной диагностики обеспечивают быстрое обнаружение вирусов в образце пациента. Это также относительно недорогие, высокочувствительные и специфические методы диагностики. Иммунологические методы широко используются для обнаружения и эпидемиологических исследований вирусных инфекций человека.Они могут обнаруживать противовирусные антитела или вирусные антигены в клинических образцах. Существует несколько коммерчески доступных наборов для молекулярной и иммунологической диагностики, которые облегчают использование этих методов в большинстве клинических лабораторий по всему миру. В развивающихся странах, включая Эфиопию, где большинство вирусных инфекций являются эндемическими, использование улучшенных или новых методов очень ограничено, поскольку эти методы очень дороги в использовании и также требуют технических навыков. Поскольку исследователи и врачи во всех уголках земного шара усердно работают, есть надежда, что в ближайшем будущем они разработают тесты хорошего качества, которые будут доступны в странах с низким уровнем доходов.

1. Введение

Вирусы — это небольшие сегменты нуклеиновой кислоты, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) в белковой оболочке или липопротеиновой оболочке (оболочке). Вирусы требуют ресурсов хозяина для их репликации, потому что они являются облигатными внутриклеточными паразитами. Как только вирусы проникают в клетки-хозяева, они захватывают или захватывают биосинтетические механизмы клеток для репликации их геномов и других компонентов [1, 2].

Вирусные инфекции — наиболее частая причина болезней человека.Миллионы людей по-прежнему умирают из-за вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирусов гепатита во всем мире. Возникающие вирусы также вызывают серьезные проблемы у населения. Например, птичий грипп A (H5N1) в 1997 г. , тяжелый острый респираторный синдром — коронавирус (SARS-CoV) в 2002–2003 гг., Вирус пандемического гриппа свиней A (h2N1) в 2009 г., вирус Эбола в 2014 г., вирус Зика (ZIKV) в 2015 г. и недавно пандемия SARS-CoV-2, среди прочего, вызвали несколько вспышек в разных странах [3–9].

Показатели заболеваемости и смертности от вирусных инфекций человека очень высоки [10]. Например, пандемическая инфекция свиного гриппа A (h2N1) в 2009 г. произошла в 214 странах, в результате чего погибло более 18 036 человек [5]. Только в 2010 году число человеческих смертей от бешенства во всем мире оценивалось в 61 000 человек, при этом 84% смертей произошли в сельской местности [11]. В 2013 г. во всем мире ВИЧ инфицировано примерно 35 000 000 человек [10]. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила 1.34 миллиона случаев смерти от вирусного гепатита в 2015 г. [12]. По состоянию на 6 января 2015 г. вирусы H5N1 убили 402 человека из 694 лабораторно подтвержденных инфекций в 16 странах [13], а уровень смертности составил около 58%. Недавно мир столкнулся с новой коронавирусной болезнью 2019 года (COVID-19). Заболевание вызвано новым коронавирусом (SARS-CoV-2). Возбудитель впервые появился в городе Ухань, провинция Хубэй, Китай, и теперь быстро распространился по всему миру [9, 14]. 11 марта 2020 года ВОЗ объявила вспышку COVID-19 глобальной пандемией.По данным ВОЗ, во всем мире зарегистрировано 9 129 146 подтвержденных случаев COVID-19, в том числе 473 797 смертельных случаев с 31 ^-го декабря 2019 года и по состоянию на 24 ^-го июня 2020 года [15]. Следовательно, для раннего и точного выявления этих вирусных инфекций требуются хорошие диагностические методы. Раннее и точное обнаружение вирусных заболеваний играет важную роль в своевременном выборе подходящей терапии, минимизации затрат на лечение, минимизации ненужных человеческих жизней и контроле над заболеванием.Это также помогает разработать соответствующие стратегии профилактики и лечения заболеваний, такие как разработка противовирусных вакцин и новых терапевтических агентов [14, 16, 17].

Традиционно лабораторная диагностика медицинских вирусов проводится путем выделения вирусов в куриных яйцах с эмбрионами, в культуре тканей или у лабораторных животных и визуального исследования вирусных частиц в образце, в том числе с использованием электронной микроскопии [16]. Многие традиционные диагностические инструменты имеют тенденцию быть громоздкими, трудоемкими, дорогими и плохо воспроизводимыми [18, 19].Напротив, молекулярные методы произвели революцию в диагностической вирусологии, обнаружив присутствие или отсутствие вирусных нуклеиновых кислот в образце пациента [18]. Иммунологические методы все еще играют большую роль для выявления и серологического надзора за вирусными инфекциями человека, несмотря на то, что многие традиционные методы заменены методами на основе нуклеиновых кислот [20]. Иммунологические методы обнаруживают вирусные инфекции путем выявления противовирусных антител или вирусных антигенов в клинических образцах [21, 22].Здесь мы описываем некоторые молекулярные и иммунологические диагностические подходы к обнаружению медицинских вирусов.

2. Методы молекулярной диагностики медицинских вирусов

Методы молекулярной диагностики на основе нуклеиновых кислот произвели революцию в диагностической вирусологии благодаря их более быстрой, высокочувствительной и высокоспецифичной диагностике [14, 23, 24]. Поскольку эти методы обнаруживают определенные последовательности нуклеиновых кислот, диагностические тесты на основе нуклеиновых кислот могут применяться для обнаружения практически любого вируса, поражающего человека [1].

2.1. Методы амплификации на основе нуклеиновых кислот

Молекулярные методы, включающие амплификацию вирусного геномного материала, чрезвычайно чувствительны и специфичны, обеспечивают быструю диагностику и позволяют обнаруживать несколько вирусов одновременно [16]. Методы амплификации нуклеиновых кислот очень полезны для обнаружения вирусов, которые невозможно культивировать или трудно и вредно для культивирования, медленно растущих вирусов в культуре и вирусов, которые проявляют антигенные вариации [1, 25].Тесты амплификации нуклеиновых кислот очень популярны при диагностике вирусных инфекций, вызванных несколькими вирусами, включая вирус гепатита С (HCV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус денге, вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирусы гриппа, вирус Зика. (ZIKV), вирус Эбола и коронавирус [26–32]. В настоящее время во всем мире доступно несколько методов амплификации нуклеиновых кислот для лабораторной диагностики вирусных инфекций, и их преимущества и ограничения будут обобщены в таблице 1.

2.1.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР является типичным примером анализа амплификации нуклеиновых кислот. Он произвел революцию в области молекулярной диагностики с тех пор, как был разработан Маллисом и Фалуной [50]. ПЦР основана на экстракции и очистке молекулы ДНК и экспоненциальной амплификации целевой последовательности с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и двух специфических олигонуклеотидных праймеров. После реакции ПЦР амплифицированный продукт может быть обнаружен несколькими методами, включая гель-электрофорез, колориметрические методы и секвенирование [10, 51, 52].С момента своего создания ПЦР использовалась для выявления вирусных инфекций человека с общей клинической чувствительностью от 77,8% до 100% и клинической специфичностью от 89% до 100% [28, 53–55]. Эти отчеты предполагают, что ПЦР может использоваться для обнаружения медицинских вирусов в различных типах образцов. Обычная ПЦР все еще используется некоторыми клиническими лабораториями по всему миру, но ее быстро заменяют более совершенные варианты этого метода.

ПЦР — очень универсальный метод.Разработан ряд вариантов общепринятой ПЦР, но наиболее важными из них являются ПЦР с обратной транскрипцией и ПЦР в реальном времени [1, 10]. Первый метод был разработан для амплификации мишеней рибонуклеиновой кислоты (РНК) [1]; второй метод был введен для количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в реальном времени в ходе реакций ПЦР [56].

2.1.2. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

ОТ-ПЦР была разработана для амплификации мишеней РНК. В этом методе обратная транскриптаза (RT) используется для преобразования вирусных РНК-мишеней в комплементарную ДНК (кДНК), а затем полученная кДНК амплифицируется с помощью стандартной ПЦР.С момента своего создания ОТ-ПЦР использовалась для диагностики заражения человека РНК-вирусами. Обычная ОТ-ПЦР продемонстрировала общую чувствительность от 73% до 100% и специфичность от 99% до 100% при обнаружении вирусной инфекции [29, 57, 58]. Эти данные показывают, что ОТ-ПЦР — отличный метод диагностики заражения человека РНК-вирусами. Однако в настоящее время этот метод обычно не используется в клинических образцах из-за его высокой стоимости и длительности процесса [14].

2.1.3. ПЦР в реальном времени

В системе ПЦР в реальном времени этапы амплификации и обнаружения вирусных нуклеиновых кислот выполняются одновременно. Обнаружение продукта амплификации зависит от количества флуоресцентного излучения образца. Эмиссия флуоресценции образца контролируется специальным термоциклером. Компьютер с соответствующим программным обеспечением, подключенным к термоциклеру, записывает данные и строит график амплификации для каждого цикла реакции [51, 59].Обнаружение и количественное определение продуктов амплификации может быть выполнено с использованием SYBR green, TaqMan и химии молекулярных маяков. Зеленый краситель SYBR связывается с малой бороздкой продукта двухцепочечной ДНК (дцДНК) и при возбуждении соответствующим светом проявляет улучшенную флуоресценцию, которая прямо пропорциональна накопленному продукту дцДНК. Зонд TaqMan представляет собой олигонуклеотид ДНК с флуоресцентным красителем, называемым репортером, прикрепленным к одному концу (5′-основание) и гасителем на другом (3′-основание) (рис. 1).Зонды TaqMan предназначены для гибридизации с внутренней областью продукта ПЦР. Во время стадии отжига ПЦР и праймер, и зонд TaqMan связываются с цепью матрицы. Когда ДНК-полимераза Taq удлиняет праймер, полимераза расщепляет зонд за счет своей 5′-3′-экзонуклеазной активности. Расщепление зонда приводит к высвобождению флуоресцентного красителя (рис. 1), что приводит к испусканию флуоресценции. Количество флуоресценции прямо пропорционально продукту ПЦР. Молекулярный маяк — это небольшая молекула ДНК с флуоресцентным красителем на 5′-конце и гасителем на 3′-конце.Последовательности на самых концах 3 ‘и 5’ дополняют друг друга. Внутренняя часть молекулы должна быть комплементарной целевой последовательности продукта ПЦР. Когда молекулярный маяк находится в свободном состоянии в растворе, он принимает структуру шпильки. Это приводит к тому, что флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости, что приводит к поглощению излучаемого света флуоресцентного красителя гасителем, и, следовательно, флуоресценция не обнаруживается (Рисунок 2 A). Однако, когда молекулярный маяк гибридизуется с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель разделяются, что приводит к испусканию флуоресценции (рис. 2 B).Количество флуоресценции прямо пропорционально продукту ПЦР [16, 42, 51, 60].

Благодаря высокой чувствительности и специфичности, короткому времени обработки результатов и простоте выполнения [33, 61], большинство лабораторий по всему миру используют ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественной оценки медицинских ДНК и РНК-вирусов. в клинических образцах. Например, Boppana et al. [39] использовали ПЦР в реальном времени для обнаружения цитомегаловируса (ЦМВ) в жидкой слюне с общей чувствительностью 100% и специфичностью 99.9% по сравнению со стандартной быстрой культурой. Этот метод также использовался для диагностики первичной инфекции EBV с общей чувствительностью 95,7% и специфичностью 100% по сравнению с серологическими анализами [62]. ПЦР в реальном времени также использовалась для определения вирусной нагрузки у пациентов с герпетическим энцефалитом [40]. Определение вирусной нагрузки в образцах от пациентов имеет решающее значение, поскольку дает прогностическую и прогностическую информацию. В этом исследовании у пациентов с более высокой вирусной нагрузкой в ​​спинномозговой жидкости (ЦСЖ) было обнаружено, что терапия ацикловиром требуется в течение более длительного времени, и у них был худший клинический результат, чем у пациентов с более низкой вирусной нагрузкой в ​​спинномозговой жидкости [40].Анализ также можно использовать для множественной идентификации различных вирусов. И зонд TaqMan, и молекулярный маяк играют решающую роль для множественной идентификации различных вирусов в одной реакции ПЦР. В мультиплексных анализах разные зонды / маяки метят разными флуоресцентными красителями [41]. В мультиплексном анализе сообщалось о чувствительности 100% и специфичности 99,6% по сравнению с иммунофлуоресцентным анализом для ПЦР в реальном времени при обнаружении аденовируса B, C и E человека в образцах мазков из зева [63].Рамамурти и его коллеги [33] сравнили мультиплексную ПЦР в реальном времени с мультиплексной традиционной ПЦР для обнаружения нейротропных вирусов (CMV, EBV, вируса простого герпеса типов 1 и 2 (HSV-1 и HSV-2), вируса японского энцефалита (JEV). и вирус ветряной оспы (VZV)) в спинномозговой жидкости. Из 147 образцов спинномозговой жидкости, собранных у пациентов с неврологическими расстройствами, ПЦР в реальном времени выявила вирусные патогены в 88 образцах, в то время как обычная ПЦР могла обнаружить вирусы только в шести образцах, что позволяет предположить, что ПЦР в реальном времени имеет более высокую чувствительность, чем обычная ПЦР.Qiu et al. [64] разработали тройной количественный анализ ПЦР в реальном времени для быстрого и дифференциального обнаружения серотипов 2, 3 и 7 аденовируса человека (hAdV) для потенциального клинического использования. Аналитическая чувствительность (предел обнаружения; LoD) этого анализа составляла 10 ² копий ДНК на реакцию для каждого из серотипов и отсутствовала перекрестная реакция с другими респираторными патогенами. Авторы пришли к выводу, что анализ чувствителен и специфичен и имеет потенциал для клинического использования для быстрого и дифференциального обнаружения и количественного определения серотипов 2, 3 и 7 hAdV в образцах человека.

Благодаря включению этапа обратной транскрипции, ПЦР в реальном времени может быть объединена с обычной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) для формирования количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR). RT-qPCR имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционным методом RT-PCR, включая снижение контаминации, возможность количественного определения ампликонов и быстрое время анализа, поскольку нет операций обработки после ПЦР [14, 51]. В результате RT-qPCR широко применяется для обнаружения и количественной оценки нескольких РНК-вирусов в клинических образцах, включая ZIKV, вирус Эбола, коронавирус, HCV, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус денге, ВИЧ-1 и грипп A вирус [30–32, 65–69].Недавно Corman et al. [32] разработали RT-qPCR для обнаружения SARS-CoV-2. Анализ направлен на ген белка оболочки (E) и ген РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) SARS-CoV-2. Были продемонстрированы высокие значения LoD в 5,2 копий на реакцию для гена E и 3,8 копий на реакцию для гена RdRp и отсутствие перекрестной реакции с другими коронавирусами, что свидетельствует о полезности метода для чувствительной и специфической диагностики COVID-19. Анализ RT-qPCR (Quanty ZEBOV FAST assay) оценивали на предмет обнаружения вируса Эбола в клинических образцах.Компания CLONIT Srl (Италия) разработала тест во время вспышки лихорадки Эбола в Сьерра-Леоне, и он имел общую чувствительность 100% и специфичность 98,63% по сравнению с RealStar® Filovirus Screen RT-qPCR Kit 1.0 (Altona Diagnostics) [31]. Gueudin et al. [68] использовали RT-qPCR для диагностики и мониторинга инфекции группы O ВИЧ-1 с LoD 40 копий / мл и специфичностью 100%. Этот метод применялся для обнаружения ZIKV в сыворотке и моче человека, и он имел LoD 2,5 БОЕ / мл и 250 БОЕ / мл в моче и сыворотке соответственно [30].Júnior et al. [70] использовали RT-qPCR для обнаружения респираторных вирусов у амбулаторных больных с острой респираторной инфекцией. Они также сравнили эффективность RT-qPCR с непрямым иммунофлуоресцентным анализом (IFA). Соответственно, с помощью RT-qPCR удалось обнаружить вирусные патогены в 88 (88/162) носоглоточных аспиратах, но IFA выявила вирусные патогены только в 33 (33/162) образцах. Данные показали, что использование RT-qPCR увеличило обнаружение вирусов на 33,9%. Сегодня коммерчески доступно несколько наборов ОТ-ПЦР в реальном времени.Например, тест qPCR в реальном времени, разработанный Cepheid AB (Саннивейл, Калифорния, США), коммерчески доступен для качественного обнаружения вируса Эбола в цельной венозной крови с ЭДТА или буккальных мазках. Анализ нацелен на гены вирусных нуклеопротеинов и гликопротеинов вируса Эбола Заир. Анализ имеет LoD 82 копий РНК / реакцию с временем обработки 98 минут. Анализ Simplexa ™ Dengue RT-PCR, разработанный Focus Diagnostics (Cypress, CA, USA), представляет собой коммерческий набор для обнаружения и типирования серотипов вируса денге 1, 2, 3 и 4 в сыворотке крови человека.Анализ нацелен на четыре области, специфичные для серотипа, а именно денге 1 (неструктурный (NS) 5 ген), денге 2 (ген NS3), денге 3 (ген NS5) и денге 4 (ген капсида). LoD анализа составляет 0,16 БОЕ / мл, 2,0 БОЕ / мл, 0,2 БОЕ / мл и 0,2 БОЕ / мл для денге 1, денге 2, денге 3 и денге 4 соответственно. Доступен набор 1.0 для ОТ-ПЦР вируса Зика Real-Star, разработанный компанией Altona Diagnostics (Гамбург, Германия), для качественного обнаружения ZIKV-специфической РНК в сыворотке или моче человека. LoD анализа составляет 0.61 копия РНК / мк л. Количественный анализ Abbott RealTime HCV, разработанный Abbott Laboratories (Rungis, Франция), коммерчески доступен для количественного определения РНК HCV в сыворотке и плазме человека. Целевая последовательность для анализа находится в высококонсервативной 5′-нетранслируемой области (UTR) генома HCV. LoD анализа составляет 12 МЕ / мл при тестировании плазмы или сыворотки человека. Тест COBAS TaqMan на ВИЧ-1, разработанный Roche Diagnostics (Бранчбург, США), коммерчески доступен для количественного определения ВИЧ-1 в плазме крови человека.ОТ-ПЦР в реальном времени нацелена на две высококонсервативные области генома ВИЧ-1, а именно на gag и длинный концевой повтор (LTR). Анализ имеет LoD 20 копий РНК ВИЧ-1 / мл. Недавно несколько разработчиков диагностических тестов разработали наборы для ОТ-ПЦР в реальном времени для COVID-19, и теперь они запрашивают разрешение на маркировку и экстренное использование (EUA) от регулирующих органов. Например, компания Co-Diagnostics (Солт-Лейк-Сити, США) разработала набор для ОТ-ПЦР в реальном времени (тест Logix Smart COVID-19) для качественного определения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 в образцах нижних дыхательных путей (например,g., бронхоальвеолярный лаваж, мокрота и трахеальный аспират) и образцы из верхних дыхательных путей (например, мазки из ротоглотки, мазки из носа и мазки из носоглотки). Набор получил маркировку EUA от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (US FDA) и CE-IVD. Анализ нацелен на ген RdRp SARS-CoV-2. LoD анализа составляет 9,35 × 10 ³ копий РНК / мл при времени работы термоциклера 63–90 минут, в зависимости от оборудования для ПЦР. Центры США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) разработали три анализа ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения генетического материала SARS-CoV-2 в образцах верхних и нижних дыхательных путей, и эта панель получила EUA от FDA США.Панель ОТ-ПЦР CDC в реальном времени нацелена на 3 кандидатные области гена нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2. LoD всех анализов составляет 5 копий РНК на реакцию. Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A ∗ STAR) и больница Tan Tock Seng (TTSH) (Сингапур) разработали тест RT-PCR в реальном времени (Fortitude Kit 2.0) для качественного обнаружения генетического материала SARS-CoV-2 в мазки из ротоглотки. Набор получил предварительное разрешение от Управления здравоохранения Сингапура (HAS) для клинического использования. FDA США еще не одобрило набор для клинического использования.Анализ имеет LoD 1000 копий РНК / мл в мазках из ротоглотки. Разработчики набора еще не раскрыли целевой ген для этого анализа. BGI Group (Пекин, Китай) разработала набор флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени для качественного определения нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2 в мазках из горла (ротоглотки), мазках из носа, мазках из носоглотки и других респираторных образцах. Компания получила сертификат EUA от Национального управления медицинской продукции Китая и FDA США на свой набор для тестирования.Анализ нацелен на открытую рамку считывания 1a и b (ORF1ab) гены SARS-CoV-2. Он имеет LoD 150 копий / мл в образцах из горла с временем обработки 4 часа. Набор для ПЦР в реальном времени RADI COVID-19, разработанный KH Medical (Корея), имеет маркировку CE-IVD и используется для качественного обнаружения SARS-CoV-2 в мазках из носа или мокроте человека. Анализ нацелен на два гена, а именно на ген спайкового белка (S) и ген RdRP SARS-CoV-2. Его объем составляет 0,66 копий / мкм, л, время обработки 80 минут.

2.1.4. Методы амплификации на основе транскрипции

Метод амплификации на основе транскрипции включает амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) и амплификацию, опосредованную транскрипцией (TMA). NASBA и TMA похожи друг на друга. Это изотермические методы усиления. Весь процесс амплификации проводится при температуре 41 ° C. В обоих случаях вирусная РНК-мишень сначала преобразуется в кДНК с помощью ОТ, а затем РНК-полимераза синтезирует множественные копии вирусного РНК-продукта.Единственное различие между TMA и NASBA в процессе амплификации заключается в том, что в случае TMA используются два фермента (RT и РНК-полимераза), в то время как NASBA использует три фермента (обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц (AMV-RT), РНКаза H и РНК-полимераза T7. ) [42, 51].

Как показано на рисунке 3, в процессе NASBA три фермента и два праймера работают вместе для экспоненциальной амплификации целевой вирусной РНК. Праймер 1 (P1) несет на своем 5′-конце промоторную область РНК-полимеразы Т7, а на своем 3′-конце P1 несет последовательность, комплементарную последовательности целевой вирусной РНК.Праймер 2 (P2) несет последовательность, комплементарную цепи кДНК. Реакция амплификации начинается с получения копии кДНК вирусной РНК путем ОТ с использованием P1. РНКаза H разрушает вирусную РНК из гибридных молекул РНК-ДНК. Затем RT синтезирует молекулы дцДНК с использованием P2 и высвободившейся цепи ДНК. Наконец, РНК-полимераза Т7 использует молекулы дцДНК в качестве матриц для транскрипции многих копий вирусной РНК. Вышеупомянутый цикл повторяется несколько раз, что приводит к накоплению множества копий вирусной РНК и дц-молекул ДНК.Амплифицированный продукт можно обнаружить либо с помощью гель-электрофореза в конце анализа, либо в реальном времени с помощью молекулярного маяка [16, 42, 43, 71]. Методы амплификации, основанные на транскрипции, имеют несколько преимуществ, например, они не требуют термоциклера, поэтому развивающиеся страны и лаборатории с ограниченным бюджетом могут позволить себе проведение анализов, у них быстрая кинетика (требуется меньше циклов), и они производят один -цепочечный продукт РНК, пригодный для обнаружения различными методами [42, 51, 71, 72].Методы амплификации на основе транскрипции подходят для диагностики вирусных инфекций человека, вызываемых РНК-вирусами. Они могут амплифицировать вирусную геномную РНК, информационную РНК или рибосомную РНК [51, 71, 73]. Ayele et al. [44] разработали анализ NASBA, в котором используются молекулярные маяки на основе gag для различения ВИЧ-1 подтипа C (C и C ‘), циркулирующего в Эфиопии. Анализ продемонстрировал высокие уровни чувствительности и специфичности для обоих радиомаяков (чувствительность 90,5% и 100% специфичность для радиомаяка C и 100% чувствительность и 95.2% специфичность для маяка C ‘), рассматривая секвенирование как золотой стандарт для генотипирования. Мур и др. [74] также использовали NSABA для обнаружения вируса гриппа A H5N1 в клинических образцах с LoD 10 копий РНК / мк мкл наряду с такой же чувствительностью, как ОТ-ПЦР, и средним временем обработки 4 часа. Анализ NASBA также использовался для обнаружения РНК вируса денге с LoD 1 БОЕ / мл для всех 4 серотипов вируса денге, без перекрестной реакции с JEV и временем обработки 3 часа [27].Ender et al. [26] использовали ТМА для скрининга донорской крови на РНК ВИЧ-1 и ВГС. Анализ ТМА показал LoD 16,2 МЕ / мл для ВИЧ-1 и 3,5 МЕ / мл для ВГС. Мультиплексный анализ NASBA использовался для одновременного обнаружения ВИЧ-1 и HCV в образцах плазмы. Было определено, что LoD анализа как для ВИЧ-1, так и для HCV составляет 1000 копий / мл и не вызывает перекрестных реакций с другими выбранными вирусами [45]. Свенсон и его коллеги [75] использовали ТМА в реальном времени для обнаружения ВПГ-1 и ВПГ-2 в образцах мазков с поражений с общей чувствительностью 98.2% и 99,4% соответственно, а специфичность 97,8% и 94,5% соответственно по сравнению с культурой. В одном исследовании анализ NASBA в реальном времени оказался более чувствительным, чем обычная ОТ-ПЦР при обнаружении норовируса. В этом исследовании ОТ-ПЦР выявила 10 мкг стандартной вирусной РНК, в то время как анализ NASBA в реальном времени может выявить 100 фг стандартной вирусной РНК [76]. Эти данные указывают на то, что эти анализы чувствительны, специфичны и экономически эффективны для обнаружения заражения человека РНК-вирусами.

Анализы на основе ТМА для обнаружения ВГС и ВИЧ-1 коммерчески доступны, разработаны Hologic (Сан-Диего, Калифорния, США).Качественный анализ Aptima HCV RNA используется для обнаружения РНК HCV в плазме или сыворотке человека. В анализе используется ТМА для амплификации консервативных областей в 5′-UTR генома HCV. Анализ имеет LoD 7,5 МЕ / мл со специфичностью 99,6%. Наборы на основе NASBA для обнаружения ВИЧ-1, ЦМВ, энтеровируса и RSV также коммерчески доступны и разработаны компанией bioMérieux Clinical Diagnostics. Анализ NucliSens Easy Q RSV A и B разработан компанией bioMérieux (Марси л’Этуаль, Франция) и используется для качественного определения RSV в респираторных образцах различных типов.Анализ основан на NASBA в реальном времени и нацелен на ген F RSV. Мур и др. [77] оценили эффективность коммерческого тестового набора с использованием 508 респираторных образцов, которые были протестированы методом прямой иммунофлуоресценции и культивирования. Было обнаружено, что анализ более чувствителен, чем анализ культуры и иммунофлуоресценции. Было определено, что чувствительность и специфичность анализа составили 99% и 87%, соответственно, по сравнению с иммунофлуоресцентным анализом со временем обработки <4 часов.

2.1.5. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP)

LAMP — еще один метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, который широко используется для чувствительного, специфичного, быстрого и экономичного обнаружения вирусов ДНК и РНК в образцах человека. Метод был впервые разработан Notomi et al. [78] и быстро завоевали популярность в диагностической вирусологии. В методе используются от четырех до шести уникальных праймеров и ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи для амплификации целевой ДНК [78, 79]. Добавление RT в реакцию LAMP (RT-LAMP) позволяет амплифицировать РНК-мишень [80].Наборы праймеров для LAMP, о которых первоначально сообщили Notomi et al. [78] включают прямой внутренний праймер (FIP), задний внутренний праймер (BIP), прямой внешний праймер (F3) и задний внешний праймер (B3). Праймеры специально разработаны для распознавания шести точных областей целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Нагамин и др. [79] позже добавили два праймера петли, а именно праймер прямой петли (LF) и праймер обратной петли (LB), чтобы ускорить анализ LAMP. Благодаря использованию от четырех до шести специфических праймеров, анализ LAMP обладает выдающейся чувствительностью и специфичностью при обнаружении нуклеиновых кислот-мишеней [79, 81].Подробное описание механизма реакции LAMP доступно в обзорах Becherer et al. [81], Tomita et al. [82], а также Silva et al. [83], которые используют иллюстрации для объяснения механизма. Реакция LAMP осуществляется при постоянной температуре от 60 до 65 ° C, что устраняет необходимость в дорогостоящем специализированном оборудовании. Для этого метода требуется только недорогой нагревательный блок или водяная баня, что делает его очень полезным в плохих лабораторных условиях [84]. Реакция LAMP занимает менее 1 часа, и амплифицированный продукт может быть обнаружен несколькими методами, включая измерение в реальном времени мутности, вызванной осажденным пирофосфатом магния, с использованием турбидиметра, визуальное обнаружение осаждения пирофосфата магния после завершения реакции. , обнаружение флуоресценции в ультрафиолетовом или естественном свете путем добавления интеркалирующего флуоресцентного красителя к конечной реакционной смеси и визуализация полос различного размера с помощью электрофореза в агарозном геле [84–87].

Анализ LAMP

был успешно использован для быстрого обнаружения ряда ДНК-вирусов в образцах человека, таких как ВПГ-1 с LoD 10 копий ДНК ВПГ-1/ мк мкл и отсутствие перекрестных реакций с другими выбранными вирусы [85], hAdV40 и hAdV41 с LoD от 50 до 100 копий ДНК / реакция, отсутствие перекрестных реакций с другими выбранными вирусами и время обработки 60 минут [88], EBV с чувствительностью 86,4%, специфичностью 100 %, по сравнению с серологическим анализом, и всего 45 минут амплификации целевых последовательностей [89], и ЦМВ с LoD 10 копий ДНК / мк мкл, отсутствие перекрестной реактивности с другими вирусами и время обработки 1 час после Экстракция РНК [90].

Возможности LAMP расширяются за счет слияния его с обратной транскрипцией (RT) в RT-LAMP, что позволяет быстро обнаруживать РНК-вирусы в клинических образцах. Недавно, например, Huang et al. [91] разработали экспресс-тест RT-LAMP для диагностики SARS-CoV-2 с LoD 80 копий вирусной РНК / мл в образце в течение 30-минутной реакции. Этот анализ был подтвержден с использованием 16 клинических образцов (8 положительных и 8 отрицательных), которые также были протестированы методом RT-qPCR. Результаты тестирования соответствовали методу RT-qPCR, предполагая, что анализ RT-LAMP можно использовать для быстрого, простого, экономичного и чувствительного обнаружения SARS-CoV-2 в респираторных образцах.Аналогичным образом Lu et al. [92] разработали метод RT-LAMP для быстрого обнаружения SARS-CoV-2 с LoD 30 копий РНК на реакцию и временем обработки 40 минут. Кроме того, Baek et al. [93] разработали экспресс-анализ RT-LAMP для раннего обнаружения SARS-CoV-2. Анализ имеет LoD, равный 100 копий РНК / реакцию, что близко к таковому для RT-qPCR с периодом быстрого обнаружения 30 минут. Анализ RT-LAMP также был разработан для выявления коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) с LoD 3,4 копий РНК MERS-CoV / реакция наряду с такой же чувствительностью, как и RT-qPCR MERS-CoV, без перекрестной реакции на другие респираторные вирусы, и результаты доступны в течение <1 часа [87].Куросаки и др. [94] обнаружили острую инфекцию вируса Эбола с помощью RT-LAMP в сочетании с портативным устройством. Чувствительность и специфичность каждого анализа составляли 100% по сравнению с RT-qPCR и временем обработки 35 минут. В одном исследовании RT-LAMP был более чувствительным, чем обычная RT-PCR и NASBA [95]. Анализ также был разработан для быстрого обнаружения вируса денге [84], вируса гриппа A (h2N1) pdm09 [96], вируса птичьего гриппа H5N1 [97], HCV [98], ВИЧ-1 [99], RSV [46] ] и ЗИКВ [100] в клинических образцах.Доступны коммерческие тест-наборы на основе RT-LAMP для обнаружения SARS-CoV-2 в респираторных образцах. Анализ разработан Color Genomics (США) и использует три набора специфичных для SARS-CoV-2 праймеров, нацеленных на ген N, ген E и область ORF1a, соответственно, и четвертый контрольный набор праймеров, нацеленный на человеческую рибонуклеазу P (RNaseP). Он имеет LoD 0,75 копий вирусной РНК / мк мкл с 70-минутной реакцией. Тест получил EUA от FDA США в респираторных образцах. Abbott Diagnostic Scarborough, Inc.(США) также разработали тест на основе RT-LAMP (анализ ID NOW ™ COVID-19) для прямого обнаружения SARS-CoV-2 в мазках из носа, носоглотки или горла. Набор получил EUA от FDA США. Анализ нацелен на ген RdRp SARS-CoV-2. LoD теста составляет 125 эквивалентов генома (GE) / мл с положительными результатами через <5 минут и отрицательными результатами через 13 минут. Наборы праймеров LAMP, такие как набор праймеров Loopamp для птичьего гриппа H5 и H7 и FluA, коммерчески доступны от Eiken Chemical Co., Ltd.(Япония).

2.2. ДНК-микрочипы

Технологии ДНК-микрочипов позволяют идентифицировать медицинские вирусы [101]. При диагностике с помощью микроматрицы ДНК флуоресцентно меченые вирусные нуклеиновые кислоты в тестируемом образце используются для скрининга массива олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на твердой поверхности (например, на предметном стекле). Используемые здесь олигонуклеотидные зонды специфичны для генома целевого вируса. Результаты гибридизации между иммобилизованными зондами и последовательностями-мишенями, меченными флуоресцентными красителями, выявляются и количественно оцениваются с помощью детекции на основе флуоресценции [16, 51, 72].

Существует обширная литература, демонстрирующая полезность микроматрицы ДНК для обнаружения медицинских вирусов в образцах человека. Чиу и др. [102] использовали микроматрицу ДНК для высокопроизводительного множественного обнаружения вирусов в образцах носоглоточного аспирата, полученных от детей, инфицированных респираторными вирусами. Анализ продемонстрировал общую чувствительность от 87% до 90% и специфичность ≥99% при обнаружении RSV, вируса гриппа A и риновируса / энтеровируса по сравнению с RT-PCR. В одном исследовании ДНК-микрочип использовался для одновременного обнаружения HSV-1/2, VZV, EBV, CMV, вируса герпеса человека 6 типов A и B (HHV-6 A / B) и аденовируса в клинических образцах с LoD 10. ГЭ / реакция для каждого вируса без перекрестной реактивности [103].ДНК-микрочип также использовался для выявления вирусных причин менингита и энцефалита с общей чувствительностью 93% и специфичностью 100% по сравнению с моновирусной ПЦР [104]. ДНК-микрочип также использовался для высокопроизводительного множественного обнаружения желудочно-кишечных вирусов [105], вирусов, передаваемых мелкими млекопитающими и членистоногими [106], вирусов герпеса, энтеровирусов и флавивирусов [107], вирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и гепатита [ 108] и двойное инфицирование двумя серотипами вируса денге [109] в образцах человека.ДНК-микрочип использовался для идентификации и генотипирования лекарственно-устойчивых мутаций ВИЧ [110, 111] для обнаружения и генотипирования лекарственно-устойчивых мутаций вируса гепатита B (HBV) [112], для обнаружения и генотипирования коронавируса SARS [113], а также для обнаружения и определить происхождение вирусов гриппа B [114]. Во время вспышки атипичной пневмонии в Китае в 2002 году микроматрица ДНК также послужила для обнаружения нового члена семейства коронавирусов [115].

Технология микрочипов ДНК — это высокопроизводительный инструмент, поскольку он позволяет множественное обнаружение большого количества потенциальных вирусных патогенов в клинических образцах [102–105].Тем не менее, этот метод имеет ряд ограничений, включая то, что он слишком дорог для использования для рутинной клинической диагностики, трудоемок и требует много времени (процесс гибридизации может занять от нескольких часов до нескольких дней). Неспецифическая гибридизация между исследуемыми материалами и иммобилизованными зондами может повлиять на чувствительность анализа. Кроме того, создание конкретных зондов требует почти полной информации о генетическом составе интересующего вируса. Анализ выявляет только те вирусные патогены, у которых есть зонды-мишени на матрице [72, 116, 117].

2.3. Секвенирование следующего поколения (NGS)

NGS очень полезно в диагностической вирусологии, поскольку может непосредственно анализировать фрагменты вирусных нуклеиновых кислот, выделенные из клинических образцов [118, 119]. Как правило, NGS включает подготовку тестового образца, секвенирование целевых фрагментов нуклеиновой кислоты с использованием одной из доступных платформ NGS и анализ данных о последовательностях с использованием подходящих биоинформатических инструментов [10, 120]. Несколько компаний производят разные машины NGS, в которых используются разные методы секвенирования, реагенты и инструменты анализа данных [119].Например, пиросеквенирование (Roche 454) обнаруживает высвобождение пирофосфата после включения нуклеотидов в процесс полимеризации ДНК. Платформы NGS компании Illumina обнаруживают высвобождение флуоресцентных меток из включенных нуклеотидов в процессе полимеризации ДНК. Новые технологии, такие как платформа Oxford nanopore (MinIon), упорядочивают нуклеиновую кислоту-мишень, ощущая ионный ток молекул ДНК / РНК, которые проходят через нанопоры [10, 119, 120]. Несмотря на высокую частоту ошибок последовательности (до 38.2%) [121], секвенатор нанопор MinION имеет преимущества перед другими платформами NGS. Во-первых, он может генерировать более длинные считывания (до 882 kb) в реальном времени [122], что делает его пригодным для полногеномного секвенирования вирусных патогенов с коротким временем обработки [123, 124]. Во-вторых, он портативен и не требует доступа в Интернет для анализа, что позволяет использовать его в полевых условиях во время вспышек вирусных инфекций [125]. В-третьих, он имеет низкие капитальные затраты, что делает его доступным в странах с низким уровнем доходов и лабораториях с ограниченным бюджетом по всему миру [121].

NGS использовался в диагностической вирусологии для нескольких приложений. Недавно Кустин и соавт. [126] использовали NGS для быстрой и надежной идентификации респираторных вирусов в клинических образцах. Его применяли для отслеживания вируса гриппа A (h2N1) pdm09 [127]. Дессилли и др. [128] использовали NGS для обнаружения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1. NGS также была проведена для обнаружения нового вируса Эбола [129].

В отличие от методов ПЦР и ДНК-микрочипов, NGS не требует предварительного знания геномных последовательностей вирусных патогенов.Также не требуются специфические для мишени праймеры ПЦР и олигонуклеотидные зонды [126, 130]. Однако использование NGS в клинических лабораториях ограничено по следующим причинам: время обработки, количество образцов за цикл, стоимость секвенсоров и необходимость навыков в биоинформатике [10, 128, 131].

3. Иммунологические методы диагностики медицинских вирусов

Гуморальная ветвь иммунной системы вырабатывает антитела в ответ на вирусные инфекции. Этот естественный ответ человеческого организма на вирусную инфекцию используется для разработки методов иммунологической диагностики.Для обнаружения вирусных инфекций человека в клинических образцах доступно несколько методов иммунологической диагностики, включая твердофазный иммуноферментный анализ, вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентный анализ и анализ ингибирования гемагглютинации. Принципы этих анализов основаны на образовании комплекса антиген-антитело и состоят из клинических образцов, целого вируса или вирусного антигена и индикатора [10, 19, 20].

3.1. Иммуноферментный анализ (ELISA)

В ELISA конъюгированные с ферментом антитела используются для обнаружения присутствия специфического противовирусного антитела или вирусного антигена в образцах человека.В положительном образце реакция между ферментом, конъюгированным с антителом, и бесцветным хромогенным субстратом приводит к образованию цветного продукта. В отсутствие антигена / антитела в клиническом образце окраска не проявляется. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству образовавшегося комплекса антиген-антитело. Изменение цвета можно наблюдать невооруженным глазом или считывать с помощью спектрофотометра, который может измерять оптическую плотность. Для ELISA использовали несколько ферментов, включая щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена (HRP) и β -галактозидазу.Существует несколько вариантов ELISA, но двумя основными типами являются ELISA с захватом антигена (также называемый сэндвич-ELISA) и ELISA с захватом антител (также называемый непрямым ELISA) [19, 132]. Как показано на рисунке 4, первый метод обнаруживает вирусный антиген путем иммобилизации антитела, специфичного для интересующего вирусного белка, на лунке для микротитрования [22]; второй метод позволяет выявлять противовирусные антитела в образце пациента путем нанесения целого вируса или вирусного белка на лунку для микротитрования [133].

ELISA чувствителен и специфичен, прост в выполнении и имеет короткое время обработки результатов.Следовательно, анализ был разработан и широко используется для обнаружения и серологического надзора за вирусными патогенами человека. Недавно Адамс и др. [134] разработали ИФА с захватом антител для обнаружения IgM или IgG к SARS-CoV-2 в образцах плазмы человека. Анализ был протестирован с использованием 40 образцов плазмы от подтвержденных ОТ-ПЦР пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, и 50 образцов плазмы от здоровых людей. Он продемонстрировал общую чувствительность 85% по сравнению с ОТ-ПЦР и специфичность 100% при обнаружении IgG или IgM к SARS-CoV-2 в образцах плазмы.Этот анализ обнаруживал уровни IgG у всех людей, положительных по ОТ-ПЦР, через ≥10 дней после появления симптомов с чувствительностью 100%. Аналогичным образом Colavita et al. [135] разработали ИФА с захватом антител для обнаружения IgG, IgM и IgA к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки. Анализ был подтвержден с использованием 553 образцов сыворотки, собранных у предполагаемых и подтвержденных случаев заражения SARS-CoV-2, у здоровых доноров и пациентов, положительных на другие инфекции или аутоиммунные состояния. Анализ показал общую чувствительность 91.7% и 97,9% для обнаружения IgG и IgA в образце сыворотки, соответственно, и специфичность> 96% для всех типов антител по сравнению с эталонным тестом IFA. Chen et al. [22] также разработали ИФА с захватом антигена для обнаружения БВРС-КоВ в клинических образцах. Анализ продемонстрировал LoD <1 нг рекомбинантного белка нуклеокапсида БВРС-КоВ / мл и специфичность 100%. ELISA с захватом антигена был разработан для быстрого обнаружения NS1 вируса денге и дифференциации серотипов DENV в образцах человека.Общая чувствительность и специфичность теста составляли 84,85% и 100% соответственно по сравнению с RT-qPCR, а уровни чувствительности для серотипирования составляли 88,2%, 94,7%, 75% и 66,6% для серотипа 1 DENV (DENV1), DENV2, DENV3 и DENV4, соответственно, без перекрестной реактивности среди серотипов [136]. ELISA также использовался для обнаружения нескольких других медицинских вирусов, включая вирус Эбола [133], HSV-2 [137], SARS-CoV [138], вирусы гепатита [139], вирус гриппа H5N1 [140] и ZIKV [ 141].

Для серодиагностики острых и перенесенных инфекций ZIKV доступен коммерческий набор для тестов на основе ELISA (Anti-ZIKV IgA, IgG или IgM ELISA), разработанный Euroimmun AG (Германия). В анализе используется ZIKV-специфический рекомбинантный антиген NS1. Общая чувствительность и специфичность анализа составляют 100% и 94% соответственно по сравнению с ОТ-ПЦР. Компания Creative Diagnostics (США) также разработала коммерческий набор на основе сэндвич-ELISA (набор для ELISA HIV 1 и 2 Ag / Ab) для качественного определения антигенов или антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в образцах сыворотки или плазмы человека.В анализе используются рекомбинантные антигены ВИЧ (гликопротеин ВИЧ-1 (gp) 41, gp120 и gp36 ВИЧ-2) и антитела к вирусному белку р24 gag. LoD теста для обнаружения антигена р24 ВИЧ составляет около 1 пг / мл. Кроме того, компания Bio-Rad (Франция) разработала коммерческий набор на основе ELISA для захвата NS1 Ag (Platelia Dengue NS1 Ag) для качественного или полуколичественного обнаружения антигена NS1 вируса денге в образцах сыворотки или плазмы человека. В анализе используют моноклональное антитело против NS1 (Mab) в качестве захватывающего антитела и конъюгат анти-NS1 Mab-HRP в качестве детектирующего антитела.Уровни чувствительности анализа, связанные с серотипом вируса, составляют 88,9%, 87,1%, 100% и 93,3% для DENV1, DENV2, DENV3 и DENV4 соответственно по сравнению с ОТ-ПЦР, а специфичность анализа составляет 100% для все серотипы. Недавно компания Euroimmun AG (Германия) разработала набор на основе ELISA для захвата антител (Anti-SARS-Cov-2 ELISA IgG) для качественного определения IgG к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки или плазмы человека. В анализе используется рекомбинантный белок S1 SARS-CoV-2 в качестве захватывающего антигена. Тест получил EUA от US FDA для использования в авторизованных лабораториях.Предполагаемая чувствительность и специфичность анализа составляют 90% и 100%, соответственно, по сравнению с тестом амплификации нуклеиновых кислот. Компания Epitope Diagnostics, Inc. (США) также разработала два типа наборов для ELISA (COVID-19 IgG ELISA и COVID-19 IgM ELISA) для обнаружения IgG и IgM к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки человека, соответственно. . В наборе для ИФА COVID-19 IgG используется рекомбинантный антиген SARS-CoV-2 и меченные HRP антитела против IgG человека. COVID-19 IgM ELISA использует антитела против человеческого IgM и рекомбинантный антиген SARS-CoV-2, меченный HRP.Анализы имеют LoD 5 МЕ / мл. Наборы одобрены FDA для клинического и исследовательского использования.

3.2. Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг (также известный как иммуноблоттинг) позволяет выявлять вирусные белки или противовирусные антитела. Для обнаружения вирусных белков денатурированные цельные вирусные белки сначала разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Затем вирусные белки переносятся электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Затем мембрану инкубируют с конъюгированными с ферментом антителами, специфичными для вирусных белков.Если вирусные белки связываются меченным ферментом антителом, добавление хромогенного субстрата приводит к образованию окрашенных полос на участках вирусных антигенов (рис. 5) [19, 132]. Для обнаружения противовирусных антител специфичные для вирусов денатурированные белки электрофоретически наносят на нитроцеллюлозную мембрану после проведения SDS-PAGE. Затем мембрану инкубируют с сывороткой пациента. Если сыворотка пациента содержит антитела против вирусных белков, они будут связываться со своими специфическими вирусными белками.Добавление конъюгированного с ферментом вторичного антитела против человека и хромогенного субстрата приводит к образованию окрашенных полос в местах расположения вирусных белков [142].

Иммуноблоттинг используется в клинической диагностике для серологического надзора и в качестве подтверждающих тестов на вирусную инфекцию человека. He et al. [143] разработали метод вестерн-блоттинга для обнаружения антител против SARS-CoV в образцах сыворотки крови человека. Анализ продемонстрировал чувствительность 98,3% и специфичность 90.9% по сравнению с IFA. Вестерн-блоттинг также использовали для обнаружения антител против вируса чикунгунья в сыворотке крови человека. Чувствительность 83,3% и специфичность 96,7% были продемонстрированы анализом с использованием 30 сывороток от подтвержденного пациента, инфицированного вирусом чикунгунья, и 30 нормальных сывороток [144]. В одном исследовании вестерн-блоттинг был многообещающим методом наблюдения за инфекцией ВИЧ-1 в регионах с ограниченными ресурсами [145]. Анализ также использовался для выявления и подтверждения инфекций ВГС и ВИЧ [146–148].Также имеется в продаже метод вестерн-блоттинга. Например, компания J. Mitra and Co. Pvt. Ltd (Мумбаи, Индия) разработала коммерческий набор (Вестерн-блоттинг на ВИЧ 1 и ВИЧ 2) для обнаружения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в образцах сыворотки или плазмы человека. В анализе используются предварительно промазанные полоски нитроцеллюлозной мембраны с выделенным вирусным лизатом ВИЧ-1 и антигеном ВИЧ-2 (gp36). Анализ имеет 100% чувствительность и 100% специфичность по сравнению с лицензированным тестом вестерн-блоттинга. Также доступен набор GS HIV-1 Western Blot для обнаружения антител к ВИЧ-1 в сыворотке, плазме или сухих пятнах крови человека, разработанный Bio-Rad Laboratories (Редмонд, США).В анализе используются предварительно промаркированные полоски нитроцеллюлозной мембраны с выделенными вирусными белками ВИЧ-1. Тест имеет 100% чувствительность и 87,2% специфичность по сравнению с лицензированным тестом вестерн-блоттинга на ВИЧ-1.

3.3. Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресцентный анализ обычно проводится для обнаружения вирусных антигенов или противовирусных антител в клинических образцах. Анализ проводится в двух форматах: прямой иммунофлуоресцентный анализ (DFA), выявляющий вирусные антигены в образце пациента [149], и непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA), который выявляет противовирусные антитела [150] или вирусный антиген [151] в клиническом образце.В DFA антитело, распознающее вирусный антиген, напрямую конъюгировано с флуоресцентным красителем. В IFA специфическое вирусное антиген-антитело немечено и обнаруживается вторым флуоресцентно меченным антителом против человека (фиг. 6). IFA более чувствителен, чем DFA, потому что несколько флуоресцентно меченых антииммуноглобулиновых антител связываются с каждым противовирусным антителом, увеличивая интенсивность флуоресценции на участке каждого противовирусного антитела. Наиболее широко используемым флуоресцентным красителем в диагностической вирусологии является флуоресцеина изотиоцианат (FITC), который излучает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию, но также доступен родамин, который излучает темно-красную флуоресценцию.После окрашивания препарат исследуют под флуоресцентным микроскопом с источником падающего УФ-света [1, 16, 132].

IFA использовался для диагностики SARS. Анализ показал 100% чувствительность и 100% специфичность в обнаружении IgG к SARS-CoV в образцах сыворотки человека по сравнению с ОТ-ПЦР [150]. Мадхусудана и др. [152] разработали IFA для обнаружения антител к вирусу бешенства в сыворотке крови человека и спинномозговой жидкости. По сравнению с тестом нейтрализации на мышах, анализ показал чувствительность 97.2% и специфичность 97,9%. IFA также использовался для прямого обнаружения антигена HSV в клинических образцах с чувствительностью 84,6% и специфичностью 95,7% по сравнению с методом культивирования тканей [151]. Более того, ИФА применяли для определения субтипов вируса гриппа А со 100% соответствием ОТ-ПЦР [153]. IFA также использовался для выявления EBV [21] и в качестве подтверждающего теста на ВИЧ-1 [154]. Что касается DFA, в одном исследовании он показал 60% чувствительность и 96% специфичность в обнаружении пандемического гриппа A (h2N1) pdm09 у детей по сравнению с RT-qPCR [149].В другом исследовании DFA показала высокую специфичность (99–100%) по сравнению с RT-qPCR для выявления RSV у детей [155]. Доступен коммерческий тест-набор на основе IFA (Anti-ZIKV IIFT), разработанный Euroimmun AG (Германия) для выявления инфекции ZIKV. В этом анализе в качестве антигена используются полные частицы ZIKV. Следовательно, может возникать перекрестная реактивность с антителами против вирусов семейства флавивирусов. Де Ори и др. [156] оценили эффективность анализа с использованием 126 положительных и 102 отрицательных образцов.Анализ показал чувствительность 96,8% и специфичность 72,5%. Компания OXOID Limited (Великобритания) разработала набор на основе DFA (тест IMAGEN на вирусы гриппа A и B) для обнаружения и дифференциации вируса гриппа A и вируса гриппа B в образцах человека. В анализе используются меченные FITC моноклональные антитела против вируса гриппа A или вируса гриппа B. Анализ имеет 100% чувствительность и 100% специфичность по сравнению с методом культивирования клеток.

3.4. Анализ ингибирования гемагглютинации (HI)

Некоторые вирусы, такие как вирус денге, аденовирус, вирус краснухи, вирус кори и вирус гриппа, имеют на своей поверхности антиген гемагглютинина, который связывает и агглютинирует эритроциты, называемые гемагглютинацией (HA).Подавление способности вирусов агглютинировать эритроциты используется для разработки анализа HI. В анализе HI серийные разведения образца сыворотки готовят в микротитровальном планшете. Затем добавляется определенное количество вирусного гемагглютинина. Наконец, добавляются соответствующие эритроциты. Отсутствие ГК указывает на положительную реакцию. Об этом судят по наклону микротитрационного планшета, который позволяет свободным эритроцитам течь (рис. 7). Регистрируют скорость разведения, при которой происходит полное ингибирование агглютинации эритроцитов.Таким образом, титр HI является обратной величиной последнего разведения сыворотки, которое полностью ингибирует HA [10, 132, 157]. HI использовался для ряда приложений в диагностической вирусологии. Анализ был использован для серологического надзора за вирусом гриппа A (h2N1) pdm09 [158] и вирусом кори [159]. В одном исследовании HI-анализ применялся для оценки эффективности вакцины против пандемического гриппа [160]. В валидационном исследовании с использованием сывороток 79 случаев, подтвержденных методом RT-qPCR, и 176 сывороток из не подвергавшейся воздействию населения, анализ HI показал высокую чувствительность (92%) и специфичность (91%) для выявления инфекции человека пандемическим вирусом h2N1 2009 г. [161 ].

Иммунологические методы диагностики широко используются в рутинной клинической диагностике вирусных инфекций человека во всем мире. Эти методы обладают рядом преимуществ, таких как высокая чувствительность и специфичность, относительно простота проведения, быстрота и возможность тестирования нескольких образцов одновременно [10, 138]. Однако иммунологические анализы имеют несколько ограничений. Анализы подвержены помехам. Помехи в иммуноанализах могут быть результатом присутствия (а) перекрестно-реактивных агентов в образце, которые несут аналогичные или те же эпитопы, что и интересующий вирусный антиген, что приводит к ложноположительному результату [10, 162]; (b) эндогенные антитела, такие как аутоантитела, гетерофильные антитела или человеческие антитела против животных в образце.Несмотря на то, что вирусный антиген отсутствует в образце, эндогенные антитела могут взаимодействовать с противовирусными антителами или детектирующими антителами, что приводит к ложноположительному результату [162, 163]. Специфичность иммуноанализа может снизиться, если они используются в эндемичных по малярии районах. Как известно, Plasmodium индуцирует неспецифическую активацию поликлональных В-клеток, что приводит к образованию неспецифических антител [164]. Эти антитела с широкой специфичностью могут реагировать с различными антигенами, что приводит к ложноположительным результатам.В одном исследовании из 34 образцов от пациентов с малярией, подтвержденных методом ПЦР, 14 образцов были положительными или пограничными на антитела против ZIKV в коммерчески доступном наборе для тестирования ZIKV ELISA. Когда эти 14 образцов были протестированы с использованием анализа нейтрализации вирусов, инфекция ZIKV не была продемонстрирована в 11 образцах [165]. Анализ HI трудоемок и требует много времени. Интерпретация результатов анализа в разных лабораториях может отличаться, поскольку для анализа отсутствуют стандартные реагенты [153, 157, 166]. В случае анализа IF длительное воздействие ультрафиолетового света на образец приводит к исчезновению флуоресценции, что может привести к ложноотрицательному результату [167].Реагенты и оборудование, которые используются в некоторых иммуноанализах, дороги [10, 11].

4. Состояние методов диагностики медицинских вирусов в Эфиопии

Большинство вирусных заболеваний эндемичны для Эфиопии [168]. Серологические обследования показали высокую распространенность HBV [169, 170], HCV [170], HIV [171] и HSV-2 [137]. Население уязвимо к бешенству [172] и гриппу [173]. Ротавирусная диарея — основная причина заболеваемости и смертности детей [174]. В последнее время, как и другие страны мира, общественное здравоохранение и сектор экономики Эфиопии серьезно пострадали от пандемии COVID-19.

Иммунологические методы, в основном коммерческие тест-наборы ELISA [137, 169] и иммунохроматографические тест-наборы [170, 175], используются для выявления вирусных инфекций в большинстве клинических лабораторий страны. Технология IFA доступна только в Эфиопском институте общественного здравоохранения для выявления инфекции вируса бешенства у собак, укусивших людей [176]. Обычная ОТ-ПЦР используется для обнаружения вируса гриппа в образцах человека в Национальной лаборатории гриппа [173].В последнее время метод RT-qPCR широко используется в нескольких исследовательских институтах, университетах и ​​клинических лабораториях для обнаружения SARS-CoV-2 в клинических образцах. Как правило, в научно-исследовательских институтах и ​​университетах для исследовательских целей используется несколько молекулярных методов, таких как обычная ПЦР и ОТ-ПЦР. Поскольку большинство лабораторий имеют ограниченный бюджет и не имеют обученного лабораторного персонала, молекулярные методы не используются для рутинной клинической диагностики вирусных инфекций человека в стране.Общенациональное использование технологий RT-qPCR для диагностики COVID-19 и полученный опыт откроют дверь для внедрения молекулярных методов для рутинного лабораторного тестирования других вирусных инфекций человека.

5. Заключение

Внедрение диагностических тестов на основе нуклеиновых кислот в диагностическую вирусологию значительно улучшило обнаружение вирусных инфекций человека. Поскольку диагностические тесты на основе нуклеиновых кислот очень чувствительны и специфичны, они играют решающую роль в диагностике медицинских вирусов и борьбе с ними.Методы молекулярной диагностики позволяют диагностировать вирусные инфекции путем обнаружения вирусной РНК или ДНК. Следовательно, с помощью этих методов можно отбирать инфицированных людей до того, как будет установлен ответ антител против рассматриваемого вируса. Это особенно важно для молодых, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом. Тем не менее, они недоступны для стран с ограниченными ресурсами из-за их высокой стоимости, сложности оборудования и необходимости в технических знаниях. Иммуноанализы также играют важную роль в диагностике и серологическом надзоре за вирусными инфекциями во всем мире.Хотя иммунологические методы просты в применении и недороги по сравнению с молекулярными методами, они не широко доступны в странах с низким уровнем доходов. Следовательно, ученые упорно трудятся над разработкой недорогих качественных тестов в странах с низким уровнем доходов. Более того, большинство стран развивающегося мира обучают своих граждан за границей и внутри страны на уровне аспирантуры, открывая соответствующие факультеты и институты.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Самый быстрый словарь в мире: Vocabulary.com

Рамановская спектроскопия как неинвазивный метод диагностики эндометриоза

Эндометриоз определяется как рост железы и стромы эндометрия за пределами полости эндометрия, вызванный оттоком в брюшную полость.Предыдущие отчеты показали, что каждая десятая женщина во всем мире обращалась за медицинской помощью из-за эндометриоза и связанных с ним симптомов, включая тазовую боль (38,7%), диспареунию (29,5%) и бесплодие (11,6%). ¹ . Учитывая, что диагноз эндометриоза зависит от гистопатологического исследования после хирургического удаления, этот подход требует индукции анестезии и госпитализации. Следовательно, это существенно влияет на качество жизни пациентов. Таким образом, исследователи сосредотачиваются на новых неинвазивных методах диагностики эндометриоза, включая трансвагинальное ультразвуковое исследование, анализ биомаркеров крови и генетическую предрасположенность.

Рамановская спектроскопия дает информацию о молекулярных структурах и химических связях веществ посредством обнаружения неупруго рассеянных фотонов ² . В рамановской спектроскопии образец освещается лазерным лучом, и наблюдается неупруго рассеянный свет, состоящий из разных частот. Рассеянный свет содержит два типа рассеяния, а именно рэлеевское и комбинационное рассеяние. Интенсивность света при рэлеевском рассеянии велика, а частоты рассеянного и падающего света одинаковы, тогда как при комбинационном рассеянии интенсивность очень мала (около 10 ^-6 интенсивности падающего луча), а частота рассеянного света отличается от частоты падающего света.Разницу между частотами рэлеевского рассеяния и неупруго рассеянных фотонов можно определить как рамановский сдвиг. Рамановские сдвиги соответствуют частотам колебаний молекул в целевом образце.

Частоты колебаний каждой химической связи внутри молекулы (например, O-H, C-O) различны, поэтому их отпечатки пальцев можно однозначно увидеть в спектре. В исследовании сообщалось, что во время болезни количество белковых биомаркеров в крови варьировалось, и эти изменения можно было идентифицировать с помощью мультиплексных и одиночных технологий иммунологического тестирования ³ .В этом контексте рамановская спектроскопия является полезным инструментом для определения химического состава образца. Биологические образцы, такие как ткань, кровь и сыворотка, хорошо подходят для измерений для рамановской спектроскопии, поскольку химические изменения сопровождают прогрессирование большинства заболеваний. Таким образом, рамановская спектроскопия имеет значительный потенциал для предоставления врачам ценной информации в области медицинской диагностики ⁴ .

Исследования показали, что диагностика заболеваний с помощью рамановской спектроскопии возможна как для образцов тканей, так и для образцов сыворотки крови.Рамановские спектры образцов сыворотки крови использовались для диагностики многих типов заболеваний, включая болезнь Альцгеймера ⁵ , рак ротовой полости ⁶ , рак носоглотки ⁷ , колоректальный рак ⁸ , инфекцию денге ⁹ , рак легких ¹⁰ , гепатит В ¹¹ и рак груди ¹² . Эндометриоз, однако, до сих пор изучался только с помощью рамановской спектроскопии через ткани. Либер и др. . Указали, что спектроскопия комбинационного рассеяния может отличать ткани, диагностированные как нормальные или эндометриоидные, от тканей, которые были диагностированы как доброкачественные, кистозные или злокачественные ¹³ .Пател и др. . показали, что стадии рака эндометрия можно различить с помощью рамановской визуализации ¹⁴ . В другом исследовании, проведенном Notarstefano et al ., Лютеинизированные клетки гранулезы были измерены с помощью рамановской микроспектроскопии для отделения эндометриоза яичников от контрольных образцов ¹⁵ .

В последнее время k-Nearest Neighbor (kNN) и машины опорных векторов (SVM) в сочетании с анализом главных компонентов (PCA) часто используются вместе со спектроскопией в диагностике заболеваний.kNN — это метод классификации, основанный на общности внутри групп; каждый отдельный спектр можно рассматривать как точку в многомерном пространстве. Этот метод вычисляет евклидово расстояние между каждой парой точек спектра. Затем, принимая во внимание большинство голосов ближайших соседей, выполняется классификация выборки ¹⁶ .

Алгоритм машины опорных векторов — это мощный контролируемый алгоритм обучения, который был представлен Vapnik ¹⁷ . Он используется в качестве метода классификации, в котором каждый элемент данных рассматривается как точка в n-мерном пространстве (n — количество функций), причем значение каждой функции является значением отдельной координаты.Классификация данных достигается путем определения гиперплоскости, которая максимизирует разницу между группами. Это элегантный подход к классификации спектральных данных ^18,19,20,21 .

В некоторых недавних исследованиях методы классификации и рамановская спектроскопия использовались вместе для диагностики заболеваний. Дингари и др. . сообщили, что рамановская спектроскопия и многомерная классификация могут различать поражения при стереотаксической биопсии молочной железы, независимо от статуса микрокальцификации. ²² .Ли и др. . разработал метод неинвазивного обнаружения рака толстой кишки с использованием рамановской спектроскопии вместе с PCA и kNN ²³ .

В этой статье мы сообщаем о первой классификационной модели на основе рамановской спектроскопии, которая может использоваться в качестве неинвазивного метода диагностики эндометриоза. Этот новый подход требует только сыворотки крови пациента с эндометриозом для диагностики заболевания. Таким образом, диагноз эндометриоза можно поставить без лапароскопии.

Mini-FLOTAC, инновационный метод прямой диагностики кишечных паразитарных инфекций: практический опыт

Аннотация

Фон

Гельминты, передаваемые через почву, и кишечные простейшие инфекции широко распространены в развивающихся странах, однако точный диагноз устанавливается редко. Целью этого исследования было оценить недавно разработанный метод mini-FLOTAC и сравнить его с более широко используемыми в настоящее время методами диагностики кишечных паразитарных инфекций в различных условиях.

Методология / основные выводы

Исследование проводилось в Дхарамсале, Химачал-Прадеш, Индия, и в Букумби, Танзания. Стул 180 учеников из двух начальных школ был проанализирован (n = 80 в Дхарамсале и n = 100 в Букумби) на кишечные паразитарные инфекции с помощью трех методов диагностики: прямого мазка фекалий, метода концентрации формол-эфира (FECM) и мини-теста. FLOTAC. В целом 72% учеников были инфицированы какой-либо кишечной паразитарной инфекцией, 24% имели двойную инфекцию, а 11% — три инфекции и более.Наиболее часто встречающимися кишечными паразитами были Entamoeba coli , Entamoeba histolytica / dispar , Giardia Кишечник , анкилостомы (и Schistosoma mansoni в Танзании). Статистически значимые различия были обнаружены в обнаружении паразитарных инфекций между тремя методами: mini-FLOTAC был наиболее чувствительным методом для гельминтозов (90% mini-FLOTAC, 60% FECM и 30% прямой мазок кала), тогда как FECM был наиболее чувствительным методом для выявления гельминтозов. чувствителен к кишечным инфекциям простейшими (88% FECM, 70% прямой анализ кала и 68% mini-FLOTAC).

Заключение / Значение

Мы представляем первый опыт использования mini-FLOTAC для диагностики кишечных гельминтов и простейших. Наши результаты показывают, что это действенный, чувствительный и потенциально недорогой альтернативный метод, который можно использовать в условиях ограниченных ресурсов, особенно для диагностики гельминтов.

Сведения об авторе

mini-FLOTAC был недавно разработан как новый прямой метод диагностики кишечных паразитарных инфекций.Mini-FLOTAC пытается решить проблему использования современных технологий, сочетающихся с высокой чувствительностью, доступностью и целесообразностью диагностики в условиях ограниченных ресурсов, где широко распространены кишечные паразитарные инфекции. Мы сравнили точность и осуществимость mini-FLOTAC с более широко используемыми в настоящее время диагностическими методами, такими как прямой мазок кала и метод концентрации формол-эфир. Наше исследование было проведено в Дхарамсале, Индия, и в Букумби, Танзания, чтобы оценить методы в различных полевых условиях и различных профилях паразитарных инфекций.Среди 180 обследованных младших школьников 72% оказались положительными на кишечную паразитарную инфекцию. Mini-FLOTAC обнаружил наибольшее количество гельминтозов (чувствительность 90%), тогда как концентрация формол-эфир была наиболее чувствительной для кишечных инфекций простейшими (чувствительность 88%). Логистические преимущества mini-FLOTAC заключаются в том, что процедура не требует какого-либо этапа центрифугирования или дорогостоящего оборудования, ее можно проводить на свежих и фиксированных образцах стула, и требуется всего 10–12 минут подготовки перед микроскопическим анализом.Наши данные свидетельствуют о том, что mini-FLOTAC является многообещающим диагностическим инструментом для диагностики гельминтов; поэтому необходимы последующие исследования в других условиях.

Образец цитирования: Barda BD, Rinaldi L, Ianniello D, Zepherine H, Salvo F, Sadutshang T, et al. (2013) Mini-FLOTAC, инновационный метод прямой диагностики кишечных паразитарных инфекций: практический опыт. PLoS Negl Trop Dis 7 (8):
e2344.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002344

Редактор: Питер Штайнманн, Швейцарский институт тропиков и общественного здравоохранения, Швейцария

Поступила: 19 ноября 2012 г .; Одобрена: 18 июня 2013 г .; Опубликовано: 1 августа 2013 г.

Авторские права: © 2013 Barda et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: BDB получил поддержку больницы Сан-Раффаэле — НПО AISPO. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Я прочитал политику журнала и обнаружил следующие конфликты: Mini-FLOTAC и FILL-FLOTAC были изобретены и запатентованы проф.Джузеппе Кринголи, Неаполитанский университет имени Федерико II, Италия.

Введение

Гельминты, передаваемые через почву (ГПГ) ( Ascaris lumbricoides , Trichuris trichiura , анкилостомоз, Strongyloides stercoralis ) и кишечные простейшие (например, Giardia dispatchinitinalis , Giardia Dispactinalis , Entamoeba, широко распространены) Entamoeba. страны, особенно в которых плохие гигиенические условия способствуют заражению яйцами, личинками и цистами при контакте с зараженной почвой, продуктами питания или водой.Гельминты, передающиеся через почву, поражают более 1 миллиарда человек во всем мире и являются частью забытых тропических болезней (NTD), которые связаны с бедностью и отсталостью [1]. Глистные инфекции, передающиеся через почву, в эндемичных странах являются основной причиной недоедания, анемии и задержки роста. Часто они связаны с незначительными симптомами, такими как подострая диарея, или могут протекать незаметно и бессимптомно, о чем часто не сообщают [2]. Кишечные простейшие инфекции (особенно G.intestinalis и Entamoeba spp.) имеют большое значение для общественного здравоохранения [3], [4]. Например, распространенность Giardia составляет 2–7% в развитых странах, тогда как в развивающихся странах она составляет 20–30% из-за загрязнения воды и пищевых продуктов [5]. Около 200 миллионов человек инфицированы во всем мире, и каждый год происходит 50 000 новых случаев. E. histolytica ежегодно поражает сотни миллионов людей; в то время как большинство людей бессимптомны, сохраняя естественный цикл организма через фекальное выделение инфекционных кист, меньшинство страдает тяжелой болезнью, связанной с инвазивным заболеванием (около 50 миллионов), и, по оценкам, ежегодно умирает 100000 человек от тяжелого инвазивного амебиаза [6 ].

Метод, рекомендованный для качественной диагностики кишечных паразитов (как гельминтов, так и кишечных простейших), представляет собой метод концентрирования формол-эфирного эфира (FECM) [7], [8], [9], выполняемый на трех разных образцах, но прямой мазок фекалий. на единичном образце чаще всего используется как метод диагностики в условиях ограниченных ресурсов. Рекомендуемый количественный метод диагностики гельминтов, передающихся через почву, — это метод Като-Каца, за исключением S. stercoralis , для которого в качестве рекомендуемых методов прямой диагностики требуется метод Берманна, агаровой чашки Кога или метод Харада Мори [8].

В последнее время методы подсчета фекальных яиц (FEC), используемые для диагностики гельминтов в ветеринарной паразитологии, такие как методы FLOTAC [10], [11] и McMaster [12], были успешно использованы для диагностики гельминтозов, передаваемых через почву. у людей [13], [14], [15], [16].

Молекулярные инструменты, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и мультиплексная ПЦР, в настоящее время становятся все более распространенными в качестве методов диагностики паразитарных инфекций в лабораториях, где имеется соответствующее оборудование, хотя в сельских и районных лабораториях в развивающихся странах этого часто не происходит [17]. , [18], [19], [20].

Несмотря на их высокую чувствительность, основным ограничением методов FLOTAC является сложность метода, который включает центрифугирование образца с помощью специального устройства, оборудования, которое часто недоступно в лабораториях в развивающихся странах [14]. Чтобы преодолеть это узкое место, в рамках «стратегии FLOTAC» по повышению качества копромикроскопической диагностики было разработано новое упрощенное устройство, а именно mini-FLOTAC. Одним из основных преимуществ этого нового метода является то, что его легче переносить и проводить в лабораториях с ограниченными возможностями из-за отсутствия стадии центрифугирования.

Целью данного исследования было оценить и сравнить широко используемые стандартные методы качественной диагностики с mini-FLOTAC в различных условиях. В настоящем отчете основное внимание уделяется диагностической точности и выполнимости различных методов, при этом особое внимание уделяется применению метода mini-FLOTAC в сельских / периферийных лабораториях с базовым оборудованием.

Материалы и методы

Заявление об этике

Общий протокол исследования по оценке mini-FLOTAC был рассмотрен и одобрен этическим комитетом медицинского факультета больницы Сан-Раффаэле, Милан, Италия.Для каждого предложенного исследовательского центра было получено отдельное этическое разрешение от местного наблюдательного совета.

Перед включением в исследование всем детям была предоставлена ​​форма информированного согласия для ознакомления и утверждения их родителями / опекунами. Все дети с положительным диагнозом кишечных паразитарных инфекций любым из использованных методов получали лечение в соответствии со стандартным протоколом, применяемым в стране. Данные оставались анонимными, а пациенты идентифицировались по коду; данные исследования были безопасно зарегистрированы и сохранены в шкафу в отделе управления данными каждого исследовательского центра и оставались конфиденциальными.

Учебные площадки

Участки исследования были выбраны среди мест, где больницы и медицинские учреждения в настоящее время сотрудничают с итальянской неправительственной организацией (Итальянская ассоциация солидарности между людьми) и больницей Сан-Раффаэле. В частности, сотрудничество было сосредоточено на учреждениях, которые нуждались в технической поддержке с лабораторной диагностикой кишечных паразитарных инфекций.

Первая часть исследования была проведена в феврале и марте 2012 года в школе в Дхарамсале, Химачал-Прадеш, Индия.Доступные данные тибетской больницы Делек показывают, что распространенность кишечных паразитарных инфекций составляет около 10% у пациентов, находящихся в амбулаторном отделении, но это число, вероятно, будет недооценено, поскольку диагностика кала проводится с помощью прямого мазка. Опубликованные данные показывают, что инфекция Giardia составляет около 20%, а наиболее распространенной инфекцией среди гельминтов, передающихся через почву, является A. lumbricoides (11%) [21], [22]. Все ученики (n = 80) школы, находящейся в ведении Департамента образования Центральной тибетской администрации в изгнании, были проанализированы на наличие кишечных паразитов.

Вторая часть исследования проводилась в мае и июне 2012 года в Букумби, округ Мванза, Танзания. В этом регионе наиболее распространенными кишечными паразитами являются анкилостомы, Schistosoma mansoni , S. stercoralis , G. кишечник и Entoamoeba spp. как определено из больничных карт на основе прямого мазка кала. Сто (n = 100) детей были случайным образом выбраны из единственной начальной школы в Букумби.

Размер выборки и рандомизация

Размер выборки был рассчитан на основе в основном исторических и неопубликованных данных о распространенности кишечных паразитарных инфекций в исследуемых районах, которая, по консервативным оценкам, составляет около 20%.Чтобы иметь идеальное количество положительных / отрицательных результатов (50%) для определения сравнения между методами, адекватный размер выборки, чтобы иметь значительную разницу с 95% доверительным интервалом (ДИ) и с 80% мощности, составлял 88 на каждом участке. .

Выбор между двумя начальными школами в Дхарамсале был произведен случайным образом, и все 80 детей были обследованы в выбранной тибетской школе. Три класса детей (2, 3 и 4 классы) единственной начальной школы в Букумби были выбраны случайным образом, и все дети в этих классах были обследованы на наличие кишечных паразитов.

Паразитологические методы

Контейнеры для стула были розданы детям вместе с формами согласия, и на следующий день у каждого ребенка был взят один образец кала (минимум 12 г) и проанализирован в тот же день. Образцы были исследованы параллельно с помощью прямого мазка, FECM и mini-FLOTAC в больничной лаборатории, а также были обработаны и прочитаны вслепую двумя опытными паразитологами (BB и DI среди авторов).

Вкратце, для проведения прямого мазка кала использовалось около 2 мг стула [7].

Что касается mini-FLOTAC, метод развился на основе методов FLOTAC [10], [11], адаптированных для выполнения методов без необходимости этапа центрифугирования. Mini-FLOTAC состоит из двух физических компонентов: основания и считывающего диска. Имеются две флотационные камеры объемом 1 мл, которые предназначены для оптимального исследования суспензий фекальных проб в каждой флотационной камере (общий объем = 2 мл) и допускают максимальное увеличение в 400 раз.

Fill-FLOTAC — одноразовые устройства для отбора проб, которые входят в состав наборов FLOTAC и mini-FLOTAC [10], [11].Они состоят из емкости, коллектора и фильтра (рисунок 1). Эти наборы облегчают выполнение первых четырех последовательных этапов техники mini-FLOTAC, то есть сбора (включая взвешивание), гомогенизации, фильтрации и розлива. Процесс мини-FLOTAC показан на Рисунке 2.

Стул обрабатывали следующим образом для базовой методики mini-FLOTAC (аналитическая чувствительность = 10 яиц или кист на грамм кала). Восемь граммов стула помещали в наполнитель FLOTAC, разбавляли 8 мл 5% формалина, тщательно гомогенизировали и фильтровали.Два мл суспензии (1 г стула + 1 мл формалина) добавляли непосредственно к 18 мл каждого из двух флотационных растворов (FS), а именно FS2 (насыщенный хлорид натрия; удельный вес (sg) = 1,20) и FS7. (сульфат цинка; sg = 1,35). Решения для флотации аналогичны описанным в протоколах FLOTAC. Раствор FS2 рекомендуется для диагностики гельминтов, передающихся через почву, раствор FS7 рекомендуется для S. mansoni и кишечных простейших [10]. Для каждого образца были выполнены два мини-FLOTAC: один был заполнен фекальной суспензией в FS2, а другой — фекальной суспензией в FS7.Перед чтением слайда и перемещением чашки для чтения в среднем требовалось 10 минут для того, чтобы яйца и цисты всплывали.

Два мл исходного раствора 1∶1 (1 г фекалий плюс 1 мл 5% раствора формалина) в fill-FLOTAC были использованы для выполнения FECM в соответствии с рекомендациями ВОЗ [7].

Было обнаружено и подсчитано

яиц с ГПГ. Кроме того, были обнаружены паразитические элементы других родов гельминтов (например, Strongyloides , Enterobius , Hymenolepis , Taenia ) и кишечные простейшие.Сравнение этих трех методов было проведено по качественной диагностике, поскольку прямой мазок и FECM не являются количественными методами.

Статистический анализ

Результаты были внесены в файл Excel. Анализ проводился с использованием программы EpiData (версия 3.1; Область анализа здравоохранения и информационных систем Панамериканской организации здравоохранения (ПАОЗ / ВОЗ), январь 2006 г.). Результаты были проанализированы с помощью таблиц сопряженности 2 × 2, и была рассчитана каппа-статистика Коэна для оценки соответствия между всеми тремя диагностическими методами.Для определения силы согласия использовалась статистика Каппа (k) с использованием следующих критериев: ≤0 = плохо, 0,01–0,20 = слабое, 0,21–0,40 = удовлетворительное, 0,41–0,60 = умеренное, 0,61–0,80 = значительное и 0,81–1 = практически идеально. Мы проверили наличие каких-либо значимых различий, вычислив интерференцию относительно пропорций (p) в двух независимых популяциях с уровнем значимости, установленным на значении p <0,05, и был рассчитан 95% доверительный интервал. Для каждого метода рассчитывались чувствительность (вероятность обнаружить «истинно» положительный случай) и отрицательная прогностическая ценность (ЧПС; вероятность того, что отрицательный результат будет «истинно отрицательным» случаем).Общее количество положительных образцов, обнаруженных любым из методов, было принято в качестве диагностического «золотого» стандарта для каждого вида паразитов.

Результаты

Из 200 студентов, которые были зачислены, 180, 47% (85/180) девочек и 53% (95/180) мальчиков в возрасте от 6 до 18 лет (средний возраст 12 лет) вернули выборку и стул анализируется на кишечных паразитов.

Результаты исследования показаны в Таблице 1, Таблице 2 и на Рисунке 3. В целом 72% (129/180) образцов были положительными на любую кишечную паразитарную инфекцию, 24% (43/180) переносили двойные инфекции. , и 11% (20/180) три инфекции и более.

Рис. 3. A) Распространенность кишечных гельминтов и простейших инфекций, выявленных каждым из трех методов.

B) Результаты исследования распространенности простейших, Entamoeba coli, Entamoeba histolytica / dispar и Giardia Кишечник.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002344.g003

Мы обнаружили разницу в распределении гельминтов по географическому ареалу: анкилостомы (20%), S. mansoni (10%), S . stercoralis и E.vermicularis (2%) были обнаружены в африканской школе, тогда как A. lumbricoides (5%), T. trichiura (2%), H. nana и Taenia spp. (1%) были обнаружены в индийской школе. Кишечные простейшие были более однородно обнаружены в двух местах исследования.

Mini-FLOTAC обнаружил большее количество гельминтозов, чем FECM или прямой мазок (38%, 22% и 11% соответственно), и различия были значительными (p <0,002 и p <0,001, соответственно).Mini-FLOTAC имел чувствительность около 90%, за ним следовали FECM и прямой мазок кала (60% и 30% соответственно). FECM выявила наибольшее количество кишечных простейших инфекций, за которыми последовали прямой мазок кала и метод mini-FLOTAC (48%, 37% и 36% соответственно). Различия между FECM и mini-FLOTAC / прямым мазком кала были значительными (p <0,04 и p <0,02, соответственно). Результаты показаны на рисунке 3. Самым чувствительным методом диагностики кишечных простейших был FECM (88%), за которым следовали прямой мазок кала и mini-FLOTAC (70% и 68% соответственно).NPV была выше 70% для всех трех методов как для гельминтов, так и для кишечных простейших, и они существенно не различались (Таблица 1).

Согласование между методами показано в таблице 2. Согласование между тремя методами было только умеренным (k = 0,40; p <0,001), а наилучшее совпадение было между FECM и mini-FLOTAC (k = 0,49–0,81; p <0,001). ). У 18 детей были обнаружены другие паразитарные инфекции, такие как A. lumbricoides , E. vermicularis , Hymenolepis nana , S.stercoralis , Taenia spp. и T. trichiura , но их было слишком мало для достоверной статистики, и они не были включены в анализ.

Принимая во внимание практическую осуществимость методов, mini-FLOTAC потребовалось приблизительно 12 минут для обработки образца: 2 минуты для подготовки образца, 10 минут для ожидания всплытия яиц / цист и 5-7 минут для считывания показаний сетки. . FECM в среднем занимал 2 минуты для подготовки образца, 10 минут центрифугирования и 3 минуты для считывания слайда (всего 15 минут).Самым простым и быстрым методом для выполнения был прямой мазок, поскольку для считывания слайда не требовалось никаких дальнейших шагов, превышающих примерно 3 мин.

Обсуждение

Впервые прибор mini-FLOTAC был использован для обнаружения гельминтов, передаваемых через почву, и других гельминтов, а также кишечных простейших и сравнен с двумя диагностическими методами, широко используемыми в паразитологии человека.

В настоящем исследовании, придерживаясь стандартных протоколов, все методы выявили одни и те же виды кишечных простейших ( E.coli , E. histolytica / dispar , G. кишечник ), тогда как mini-FLOTAC выявил больше видов гельминтов, чем два других метода ( E. vermicularis был обнаружен только с mini-FLOTAC и T. trichiura не был обнаружен прямым мазком кала). Число особей, идентифицированных как положительные с помощью каждого метода, значительно варьировалось от одного вида к другому.

Наши результаты показывают, как и Levecke et al [23] для FLOTAC, что mini-FLOTAC оказался наиболее чувствительным методом (95% положительных образцов) для диагностики гельминтов.Важным наблюдением нашего исследования является то, что диагностическая точность изменений mini-FLOTAC в соответствии с используемым FS: анкилостомоз и E. vermicularis были более точно диагностированы с помощью FS2, в то время как S. mansoni был диагностирован с более высокой чувствительностью с помощью решение FS7, таким образом поддерживая применение метода FLOTAC [11], [24].

При рассмотрении кишечных простейших инфекций картина диагностики меняется, и наши результаты демонстрируют относительно низкую эффективность mini-FLOTAC.Эти данные существенно отличаются от данных, представленных Becker et al. [13], где было обнаружено, что FLOTAC более чувствителен к обнаружению E. coli и G. кишечник , тогда как FECM был более чувствителен к E.histolytica / dispar . Однако следует учитывать, что стадия центрифугирования делает FLOTAC отличным от мини-FLOTAC и не позволяет легко сравнивать его с mini-FLOTAC, особенно для диагностики кишечных простейших. В настоящих документах мы не сравнивали FLOTAC с mini-FLOTAC, поскольку последний не является заменой первого, но эти два метода следует использовать в различных лабораторных условиях в зависимости от имеющихся средств и оборудования.Однако мы поняли, что стандартное прямое сравнение метода mini-FLOTAC и метода FLOTAC может быть важным как для сравнения чувствительности методов, так и для оценки их осуществимости и рентабельности.

Для диагностики простейших в районах с высокой паразитарной нагрузкой и ограниченными ресурсами прямой мазок можно считать достаточным методом, так как в этом исследовании он не теряет слишком большую чувствительность по сравнению с FECM. Стоит отметить, что в нашем исследовании чувствительность прямого мазка кала для диагностики г.кишечник был даже больше, чем FECM, что можно объяснить тем фактом, что большинство образцов были положительными на трофозоиты, которые были убиты консервированием формолом, и поэтому дали отрицательные результаты при использовании двух других методов.

Наше исследование страдает некоторыми ограничениями, которые могут частично объяснить несоответствие между тремя методами паразитарной диагностики. Согласие между тремя методами было переменным (значения k варьировались от 0,4 до 0,8), но в целом умеренным (k = 0.6). Низкое согласие в диагностике простейших наблюдалось в других исследованиях, в которых один и тот же набор образцов анализировался в разных справочных лабораториях [25]. Из-за низкой распространенности других гельминтозных инфекций результаты этого исследования в основном основаны на диагнозе анкилостомы и S. mansoni , и необходимы дальнейшие исследования в различных условиях, чтобы сформулировать более надежные и окончательные рекомендации по использованию mini-FLOTAC для других почв. -диагностика перенесенных гельминтов.

Важно учитывать, что метод mini-FLOTAC все еще находится в стадии доработки, и необходимо более подробно рассмотреть два основных аспекта, особенно для диагностики кишечных простейших.Во-первых, важную роль играет консистенция стула, особенно при легких инфекциях, поскольку жидкий стул содержит меньшее количество кист. Слизистый стул можно обрабатывать добавлением мукозолванта или, если лабораторные помещения могут себе это позволить, можно выполнить стадию центрифугирования с эфиром, чтобы удалить остатки. Видимость внутренних структур часто ухудшается из-за обломков, что затрудняет дифференциацию между Entamoeba spp. Более того, показания при большом увеличении звездной величины (400 ×) не были четкими, поскольку считывающий диск mini-FLOTAC еще не обеспечивает идеальной видимости.

Во-вторых, mini-FLOTAC был протестирован только с использованием двух различных флотационных растворов (насыщенный NaCl и сульфат цинка), но можно было протестировать и другие FS и сравнить видимость образцов. Более того, флотационный раствор взаимодействует и может изменять внешнюю мембрану паразитов (таких как E. coli , G. Кишечник , S. mansoni ), так или иначе искажая их изображения по сравнению с классическим рисунком. По этой причине для чтения mini-FLOTAC необходимы хорошо обученные лаборанты, и обучающий Атлас, который может помочь при чтении образца, может быть полезным инструментом для добавления в набор mini-FLOTAC.

Преимущество метода mini-FLOTAC заключается в том, что он позволяет работать с фиксированным образцом фекалий, но также может выполняться на свежих образцах. Это дает возможность исследовать образцы в разные дни, а также улучшает процесс контроля качества; Кроме того, комбинированное использование устройства fill-FLOTAC предотвращает любую опасность заражения оператора.

Необходима серия исследований для сравнения количественных характеристик mini –FLOTAC с другими рекомендованными стандартными методами диагностики гельминтов, такими как Kato Katz и McMaster.Это важный аспект борьбы с гельминтами, поскольку интенсивность инфекций, измеряемая в количестве яиц на грамм, напрямую связана с заболеваемостью и является важным показателем для мониторинга воздействия программ борьбы, а также эффективности лекарств [23], [26]. Предварительные качественные результаты эффективности mini-FLOTAC в этом исследовании должны способствовать планированию надежного независимого многоцентрового исследования, в котором сравнивается mini-FLOTAC со стандартными протоколами как по качественной, так и количественной диагностике гельминтозов.

Принимая во внимание рентабельность и осуществимость методов, мы продемонстрировали, что mini-FLOTAC требует примерно того же времени для обработки образца, что и FECM. Что касается стоимости оборудования, единственные затраты на mini-FLOTAC (помимо стоимости набора, который в настоящее время предоставляется бесплатно для исследовательских целей) — это покупка хлорида натрия (NaCl) и сульфата цинка (ZnSO _4). ) для флотационных растворов, тогда как для FECM требуется центрифуга, формол и эфир, которые не всегда легко купить, особенно в лабораториях с ограниченными ресурсами.Все считывающие диски mini-FLOTAC и емкости для наполнения FLOTAC можно использовать повторно после тщательной мойки. Однако следует принимать во внимание тот факт, что сульфат цинка является довольно дорогой солью и ее нелегко получить в периферийных лабораториях.

В заключение, это исследование демонстрирует, что mini-FLOTAC определенно является чувствительным и относительно простым методом качественной диагностики гельминтозов, хотя его еще можно улучшить для диагностики кишечных простейших.Мы считаем, что эта работа является шагом вперед в борьбе с NTD, потому что пренебрежение диагностикой поддерживает порочный круг скрытых заболеваний и плохой доступ к клиническому ведению и лечению. Наиболее необходимы инновационные инструменты прямой диагностики, которые сочетают современные технологии и чувствительность с доступностью и осуществимостью в условиях ограниченных ресурсов, и разработка набора mini-FLOTAC является шагом вперед в этом направлении.

Благодарности

Мы благодарны Рубену Чимино за советы по статистическому анализу.Особая благодарность учителям букумби и тибетских школ, которые с энтузиазмом участвовали в опросах. Mini-FLOTAC и fill-FLOTAC были изобретены и запатентованы профессором Джузеппе Кринголи, Университет Неаполя Федерико II, Италия. Авторы выражают признательность Джузеппе и Массимо Федерико (IDEAL PLASTIK SUD srl) за их технический опыт и энтузиазм в участии в разработке устройств mini-FLOTAC и fill-FLOTAC.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: BDB MA LR GC.Проведены эксперименты: BDB DI HZ. Проанализированы данные: BDB LR MA DI. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: GC MC FS TS. Написал статью: BDB MA LR FS DI GC.

Ссылки

1. 1.
   ВОЗ (2010). Работа над преодолением глобального воздействия забытых тропических болезней. Первый доклад ВОЗ о забытых тропических болезнях. Женева, Всемирная организация здравоохранения (WHO / HTM / NTD / 2010).
2. 2.
   Хотез П.Дж., Фенвик А., Савиоли Л., Молинье Д.Х. (2009) Спасение беднейшего миллиарда посредством борьбы с забытыми тропическими болезнями.Ланцет 373: 1570–5.
3. 3.
   Балдурссон С., Каранис П. (2011) Передача простейших паразитов через воду: обзор мировых вспышек заболеваний — обновленная информация за 2004–2010 годы. Water Res 45: 6603–14.
4. 4.
   Marshall M, Naumovitz D, Ortega Y, Sterling CR (1997) Водные патогены простейших. Clin Microbiol Rev 10: 67–85.
5. 5.
   Savioli L, Smith H, Thompson A (2006) Giardia и Cryptosporidium присоединяются к «инициативе по забытым болезням».Тенденции Parasitol 22: 203–208.
6. 6.
   Хименес К., Моран П., Рохас Л., Валадес А., Гомес А. (2009) Переоценка эпидемиологии амебиаза: современное состояние. Заразить Genet Evol 9: 1023–1032.
7. 7.
   ВОЗ (1994) Судебные средства для диагностики кишечных паразитарных инфекций. Женева: Всемирная организация здравоохранения.
8. 8.
   ВОЗ (1992) Диагностическая паразитология. Женева: Всемирная организация здравоохранения.
9. 9.
   Suwansaksri J, Nithiuthai S, Wanitkit V, Soogarun S, Palatho P (2002) Метод концентрации формол-эфир для кишечных паразитов, сравнивающий 0.1 н. Гидроксид натрия с физиологическими препаратами. Юго-Восточная Азия J Trop Med Public Health 33: 97–98.
10. 10.
    Cringoli G (2006) FLOTAC, новый прибор для поливалентного подсчета яиц в фекалиях. Parassitologia 48: 381–384.
11. 11.
    Cringoli G, Rinaldi L, Maurelli MP, Utzinger J (2010) FLOTAC: новые поливалентные методы качественной и количественной копромикроскопической диагностики паразитов у животных и людей. Nat Protoc 5: 503–515.
12. 12.Министерство сельского хозяйства, рыболовства и продовольствия Великобритании (1971) Руководство по методам ветеринарных паразитологических лабораторий. См. Книгу 418: 5–12.
13. 13.
    Беккер С.Л., Лохориньон Л.К., Шпайх Б., Ринальди Л., Кнопп С. и др. (2011) Сравнение двойного метода Flotac-400 и метода концентрирования формалина и эфира для диагностики кишечной инфекции человека простейшими. J Clin Microbiol 49: 2183–2190.
14. 14.
    Кнопп С., Глинц Д., Ринальди Л., Мохаммед К.А., Н’Горан Е.К. и др.(2009) FLOTAC: многообещающий метод обнаружения яиц гельминтов в человеческих фекалиях. Trans R Soc Trop Med Hyg 103: 1190–1194.
15. 15.
    Левеке Б., Ринальди Л., Шарлье Дж., Маурелли М.П., ​​Боско А. и др. (2012) Систематическая погрешность, точность и прецизионность результатов теста на сокращение количества яиц в фекалиях крупного рогатого скота с использованием методов McMaster, Cornell-Winsconsin и FLOTAC. Vet Parasitol 188: 194–199.
16. 16.
    Утцингер Дж., Ринальди Л., Лохориньон Л.К., Ронер Ф., Циммерманн МБ и др.(2008) FLOTAC: новый чувствительный метод диагностики анкилостомозов у ​​людей. Trans R Soc Trop Med Hyg 102: 84–90.
17. 17.
    Santos HL, Peralta RH, De macedo HW, Barreto MG, Peralta JM (2007) Сравнение мультиплексной ПЦР и обнаружения антигена для дифференциальной диагностики Entamoeba histolytica . Braz J Infect Dis 11: 365–370.
18. 18.
    Taniuchi M, Verweij JJ, Noor Z, Sobuz SU, Lieshout L и др. (2011) Высокопроизводительная мультиплексная ПЦР и обнаружение на основе зондов с помощью гранул Luminex для семи кишечных паразитов.Am J Trop Med Hyg 84: 332–337.
19. 19.
    Джекс А.Р., Стэнли К.К., Ло В., Литтман Р., Вервей Дж. Дж. И др. (2012) Обнаружение диарейных патогенов в человеческих фекалиях с помощью автоматизированной роботизированной платформы. Зонды клеток Mol 26: 11–15.
20. 20.
    Verweij JJ, van Lieshout L (2011) Кишечные паразитарные инфекции в промышленно развитой стране; новый акцент на детях с улучшенной диагностикой на основе ДНК. Паразитология 138: 1492–1498.
21. 21.
    Сингх П., Гупта М.Л., Такур Т.С., Вайдья Н.К. (1991) Кишечный паразитизм в Химачал-Прадеше.Индийский журнал J Med Sci 45: 201–204.
22. 22.
    Singh S, Raju GV, Samantaray JC (1993) Паразитарная кишечная флора у населения Северной Индии с желудочно-кишечными симптомами. Троп Гастроэнтерол 14: 104–108.
23. 23.
    Levecke B, De Wilde N, Vandenhoute E, Vercruysse J (2009) Полевая применимость и осуществимость четырех методов обнаружения Trichuris у обезьян: модель для мониторинга эффективности лекарств в общественном здравоохранении? PLoS Negl Trop Dis 3: e366.
24. 24.Глинц Д., Силуэ К.Д., Кнопп С., Лохориньон Л.К., Яо К.П. и др. (2012) Сравнение диагностической точности Kato-Katz, чашки с агаром Кога, концентрации эфира и FLOTAC для Schistosoma mansoni и гельминтов, передаваемых через почву. PloS Negl Trop Dis 4: e754.
25. 25.
    Утцингер Дж., Ботер-Клейвен С., Кастелли Ф., Кьодини П.Л., Эдвардс Х. и др. (2010) Микроскопическая диагностика ацетата натрия — уксусной кислоты — формалина — фиксированных образцов стула для гельминтов и кишечных простейших: сравнение европейских справочных лабораторий.Clin Microbiol Infect 16: 267–273.
26. 26.
    Левеке Б., Бенке Дж. М., Аджампур ССР, Альбонико М.