Методы диагностирования: Диагностические признаки, методы диагностики и основное оборудование

Диагностические признаки, методы диагностики и основное оборудование

Вибрация, шумы, биение, стуки, утечка жидкостей и другие внешние проявления нарушений нормального рабочего процесса являются признаками неисправности механизма или агрегата автомобиля. В диагностике признаки используются как носители информации о техническом состоянии механизма; предельное значение признака определяет необходимость обслуживания или ремонта, темп изменения признака — ресурс работы до очередного обслуживания или ремонта. Часто один простой признак несет узкую информацию о состоянии механизма и не обеспечивает должного представления о техническом состоянии механизма. Например, контроль зазора между контактами в прерывателе системы зажигания (в статическом состоянии) не позволяет определить его техническое состояние. Проверка же угла замкнутого состояния контактов на работающем двигателе отражает не только износ контактов, но и износ кулачка, кулачкового валика, упругости пружины и форму поверхности контактов. Такой признак, несущий более широкую информацию, называется комплексным. Для диагностики автомобиля в целом комплексные признаки могут быть более общими. Например, расход топлива и масла автомобилем, мощность двигателя, накат и другие.

Зная предельное значение признака и его изменение по мере пробега, можно определить ресурс безотказной работы механизма, периодичность обслуживания и пробег автомобиля до ремонта.

Определение оптимальной последовательности отыскания неисправностей является сложной технической задачей, которая пока полностью не решена.

Оценка технического состояния механизма агрегата или системы производится по двухмерной системе: «годен—негоден», «ниже—выше». В качестве оборудования для определения и регистрации параметров технического состояния применяют стенды, передвижные и пепсиосные с ручным управлением, а также с полуавтоматическими или автоматическими устройствами.

Схема стенда с беговыми барабанами для диагностики автомобилей показана на рисунке:

Рис. Стенд с беговыми барабанами:
1 — рама; 2 — беговой барабан; 3 — муфта, разобщающая барабаны при испытании тормозов; 4 — втулочно-пальцевая муфта; 5 — генератор балансирного типа; 6 — пульт управления; 7 — электродвигатель постоянного тока; 8 — генератор постоянного тока

Для определения технического состояния трансмиссии по полному сопротивлению, тормозов и отдельных агрегатов — по параметрам вибрации, генераторы постоянного тока балансирного типа работают в режиме электродвигателя и прокручивают агрегаты автомобиля.

При замере крутящего момента, мощности, подводимой к задним колесам, расхода топлива и других параметров балансирные генераторы приводятся во вращение колесами автомобиля и работают в режиме генератора, отдавая ток на нагрузочные сопротивления. На подобных стендах в сочетании с дополнительными приборами можно проводить все основные работы по диагностике автомобиля, например, определять изменение мошностных показателей при различных нагрузках и оборотах коленчатого вала двигателя по развиваемой мощности, определять топливную экономичность, действия тормозов и др.

Ориентировочные расчеты и результаты работ некоторых автохозяйств показывают, что при внедрении диагностики общие затраты на техническое обслуживание и текущий ремонт снижаются на 10—15%.

Методика автомобильной диагностики

Что такое «методика» знают многие, это «… некий готовый «рецепт», алгоритм, процедура для проведения каких-либо нацеленных действий. Близко к понятию технология. Методика отличается от метода конкретизацией приёмов и задач. Например, математическая обработка данных эксперимента может объясняться как метод (математическая обработка), а конкретный выбор критериев, математических характеристик — как методика». https://goo.gl/kcJnxy
Когда я спросил Дмитрия Юрьевича:
— Какой методикой вы пользуетесь для проведения диагностики?
То по его взгляду понял, что вопрос немного некорректен, или даже «туповат». Он пожал плечами и коротко ответил:
— Смотрите сами.
Смотрю. Вот как видит процесс диагностики автомобиля «человек со стороны», клиент или кто-то ещё:

Ну и для чего эти люди собрались перед капотом? Или зачем их «главный» (Дмитрий Юрьевич), постоянно отвлекается на монитор?

А это уже и есть «методика».
Действительно, вот жалуется, например, клиент на нестабильность холостого хода. Что делать, куда смотреть, что смотреть?
Порядок осмотра в этом автосервисе http://mek1.ru/ давно отработан («порядок осмотра – это метод из нужной методики).
Дмитрий Юрьевич выбирает параметры для просмотра:

Выбирает те данные, которые, по его мнению, требуются для проверки при озвученных жалобах клиента. Запускается мотор и начинается их изучение:

Пока Дмитрий Юрьевич анализирует информацию, его команда » ворон не ловит», а действует по своему плану (могу даже сказать – «алгоритму», так как каждый знает что ему делать, в какой очерёдности).
Антон готовит мотор к проверке системы зажигания:

Как давно понял, в автосервисе Дмитрия Юрьевича используется только качественное оборудование. Пусть дорого, да, зато результаты работы оправдывают подобные покупки и приобретения: для проверки системы зажигания используется линейка производства фирмы SUN (США). Это не реклама, нет. Это обыкновенная «констатация факта» — хорошее оборудование для автомобильной диагностики стоит дорого, но оно того стоит: это и скорость работы, и точность; всё это выливается в тот результат, за которым клиент приехал: «Гарантированная правильность выводов проведённой диагностики автомобиля».

Дмитрий (слева), отщёлкивает крепежи для снятия и проверки воздушного фильтра:

Чуть выше я говорил насчёт «гарантированной правильности выводов диагностики». Хочу дополнить: диагностическое оборудование таких выводов не делает. Дорогое оно, или нет, но оборудование только помогает делать вывод и только предоставляет информацию для тех выводов, которые должен сделать автомобильный диагност. Что и видно на следущем фото:

Раньше я говорил, что в этом автосервисе получаемые от сканера или мотортестера данные выводятся сразу на несколько мониторов. Здесь Дмитрий Юрьевич как раз смотрит на такой дополнительный монитор и нажимает педаль газа. Удобно. В ином случае пришлось бы отвлекать человека из команды – а у него на данный момент своя работа.
Раньше, при просмотре данных было определено, что мотор под капотом – GDI-5 второго поколения. И давление для него явно недостаточно. При перегазовке определяется отработка насосом (ТНВД) требуемого давления при повышенных оборотах и на холостом ходу.
На графике и по другим данным:

Определяется, что на высоких оборотах ТНВД своё давление отрабатывает, а вот на ХХ – нет. Вот здесь (на фото ниже), всё становится понятным:

При данных условиях давление не должно быть 4.5 MРa, оно должно быть 7.0 MРa. Это означает, что ТНВД нуждается в осмотре и, наверное, в ремонте.
Но это не «вся диагностика», как можно подумать. Хотя в некоторых автосервисах на этом дело и заканчивается: «Мы компьютером посмотрели и вывод такой …». Нет, «посмотреть сканером и сделать вывод» — это начальный класс автодиагностики.
Дальше при помощи оптического зонда:

Осматривается горловина бензобака.

При помощи джойстика зонд можно поворачивать и осматривать всё, что поможет сделать точный и окончательный вывод о состоянии горловины бензобака:

Владельцы автомобилей, автодиагносты уже знают, что из-за коррозии горловины топливного бака часто «умирает топливный насос». Но нет, здесь всё в порядке. Однако проверить надо было обязательно. Это тоже «методика».
Но и это ещё не всё. Пока осматривался бензобак, мотор был подготовлен к «визуально-техническому» осмотру:

И казалось бы: «Что здесь смотреть?». Или: «И что на него смотреть? Мотор как мотор … «.
Проверяется течь масла масляного насоса. Проверяется ремень ГРМ. Здесь он относительно свежий, 2012 года, но сальники уже начали подтекать …

Нижняя защитная крышка.

Зачем на неё смотреть? Есть ли смысл? Или создаётся «видимость работы»?
А затем, что на крышке расположены крепления датчика коленчатого вала. И здесь крепёж, фактически, болтается — нет одного болтика. Если бы сейчас сюда не заглянули и не ознакомили с результатами осмотра клиента, то вполне вероятно, что в какой-то момент мотор мог «непонятно и неожиданно заглохнуть» — разъём без предусмотренного крепления может «отойти» на первой или второй кочке. И контакта нет. И мотор заглох. И клиент наверняка бы подумал: «Ну вот … накрутили-наремонтировали в сервисе неизвестно что…». Так часто бывает.
Но и это не всё.
Проверяется внутреннее состояние мотора: камера сгорания, клапана, поршня, количество нагара:

А ниже очень интересное фото:

Вроде бы обычный снимок. Ну и что такого, что помощник, Антон, осматривает изнутри мотор в тех же местах, где до него только что смотрели. Проверяет? Дмитрий Юрьевич себе не доверяет?
А это, между прочим, относится не только к слову «методика», но и к слову «обучение». Когда Дмитрий Юрьевич передаёт зонд Антону, то это означает: «Посмотри. Поучись. Там есть нагар. Забирай в свою копилку».
А зонды хорошие. Качественные:

Ну и напоследок – осмотр свечей зажигания:

Теперь почти всё. Теперь Дмитрий Юрьевич записывает полученные результаты и пожелания клиенту:

И докладывает старшему по ремзоне результаты диагностики, а тот будет дальше общаться с клиентом:

Второй автомобиль, Mitsubishi Chariot, который прибыл на диагностику («троит»), проходил осмотр точно так же:
1. Определяется неисправный элемент, катушка и свеча извлекаются.

2. Для того, чтобы общая картина при проверке не смазывалась, устанавливается рабочие катушка, свеча (выше всех остальных):

Теперь ничего не мешает «увидеть картину целиком»: выбрать нужные параметры и приступить к их изучению:

И обратите внимание на Антона (справа):

Понаблюдав за ним, сделал вывод, что человек перспективный, ему не нужно напоминаний типа «посмотреть и поучиться», он всегда сторожит действия Дмитрия Юрьевича, сам везде наблюдает и учится.

Так как основное подозрение на систему зажигания, она проверяется так же тщательно:

И на холостом ходу, и при оборотах:

Методика, вроде бы, точно такая же, только в этом случае «построение методики отталкивается от подозреваемой неисправности» и некоторые шаги методики меняются. Но основные элементы проверок всё равно остаются:

Меняется всё, что вызывает подозрения и что скоро может выйти из строя:

Такой тщательный осмотр продиктован тем, что этот автомобиль здесь стоит на обслуживании, но на осмотре (ТО) не был уже давно.

Третий автомобиль Mitsubishi Pajero – и другая методика. Здесь мотор работает нестабильно, он «или троит, или умирает». Может заглохнуть.

На панели приборов горят подсказки для проверяющих:

Мотор как мотор. И где тут неисправность спряталась?

Обратите внимание, какие параметры для проверки выбраны:

Именно после просмотра показаний, Антон уменьшается в размерах и лезет куда-то под руль …

И для чего?..
А раскладка мыслей была такая:

— автомобиль обслуживался в другом автосервисе

— для устранения причин нестабильной работы двигателя, там решили принудительно повысить обороты ХХ путём вольного сдвигания APS в какую-то сторону.

— в результате: обороты ХХ они «как-то сделали»

— но не знали, что при такой «регулировке» вышли в динамический диапазон по APS «автомобиль в движении», то есть, в диапазон, который «подхватывается» только датчиком скорости (педаль нажата, причём в том положении, когда должен работать датчик скорости.
Знали ли в том автосервисе, что:

· Датчик регистрирует положение педали акселератора и передает

· сигнал в блок управления двигателем.

· Датчик положения педали акселератора имеет два
регистрирующих контура.

· Этот датчик представляет собой разновидность потенциометра, который преобразует информацию о положении педали акселератора в электрический сигнал напряжения, направляемый в блок управления двигателем.

· При помощи измерительных цепей датчика производится регистрация скоростей нажатия и отпускания педали акселератора, информация о которых передается в блок управления двигателем в виде сигналов напряжения.

· На основе этих сигналов блок управления двигателем регистрирует текущую величину угла поворота педали акселератора при её нажатии — и на основе этих сигналов управляет электродвигателем привода дроссельной заслонки.

· Отпущенное положение педали акселератора ( или «положение холостого хода»), определяется блоком управления двигателем на основе сигнала от её датчика.

· Блок управления двигателем использует этот сигнал при организации управления двигателем, например, управляя отключением топливоподачи на принудительном холостом ходу.

· И говорит ли что вот это: «1250 mv для обоих каналов на холостом ходу?»

Итого: при таком положении датчика педали газа, нормального (положенного) холостого хода не может быть по определению.

Вот по этой причине, для правильной регулировки APS, Антон забрался под руль.

В результате вот что получилось:

Для чего нужно было в первую очередь заниматься настройкой APS?
Только для того, чтобы «выровнять картину осмотра», убрать нестабильность ХХ и изучать работу двигателя без ненужных помех.
Дальше всё по отработанной методике. Осмотр мотора:

Осмотр поршней, клапанов, определение количества сажи, осмотр развала двигателя (сколько гаек туда набросали предыдущие специалисты) …

Подготовка и проверка давления в топливной системе:

Проверка состояния горловины топливного бака:

И вывод:
— горловина заменена. Не новая, но вполне хорошая
— топливоподача проблематичная: нужное давление насос качает, но за слишком большое время … хотя нижний предел в 3 Kpa преодолел
Этот ТНВД ремонтировался в автосервисе Дмитрия Юрьевича в 2008 году. Времени прошло много. И неизвестно какое топливо использовалось. Поэтому ТНВД надо проверить и попытаться «подделать». Или заменить.

Ну а я делаю другой вывод. Мы же говорили о «методике»? Так вот … вспоминания свои предыдущие посещения этого автосервиса, и нынешнее, внимательно наблюдая за действиями диагностов, могу сказать, что «методика – это как патронташ у стрелка.

Каждый патрон – это определённый набор действий для диагностической ситуации. И диагност должен знать, какой патрон выбрать, и сколько их требуется на данный момент. Это и есть «методика». И уточняю:
· Патрон – это метод
· Выбор количества патронов в определённой ситуации – это уже методика
И квалификация автомобильного диагноста заключается в том, сколько у него имеется вот таких «умственных патронов и патронташей». Всё остальное – трёп по ушам.
Обратил внимание вот на что:
· Кроме «желательно-обязательной» накидки на крылья автомобиля, используется и вот такая очень удобная ступенька:

Если не купить, то сделать такую просто. Удобнее будет осматривать мотор.

· Автосервис разделён на зоны. На фото ниже – рабочее место для очистки форсунок:

· В штате автосервиса есть «Старший по автосервису»

В его функции входит приёмка-отдача автомобилей клиенту, все переговоры с клиентами, запись на ремонт, решение вопросов и пожеланий клиента. Тем самым, основное звено – автодиагносты, освобождены от переговоров с клиентами (а согласитесь, такие переговоры могут быть самыми разными, от доброжелательных до дипломатических скандалов?).
И последнее: «Что меня совсем не удивило».
Знаю Дмитрия Юрьевича с 2004 года. И сколько мы с ним знакомы, сколько приезжаю к нему, а картина не меняется – у него всегда есть очередь автомобилей на ремонт. Даже сейчас, в кризис. И когда читаю или слышу, что «клиентов нет … да и праздники на носу … кризис в стране, слышал о таком?!», то хочется посоветовать изучить методику организации диагностики и ремонта этого автосервиса. А на странице: http://mek1.ru/karta-sajta1.html , по карте сайта, можно найти довольно интересные материалы как для автолюбителей, так и для автодиагностов – если кто-то ещё не ходил по этому адресу.

Кучер Владимир Петрович

Союз автомобильных диагностов

© Легион-Автодата

МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ — КиберПедия

Клиническая диагностика отличается от обычного психологиче­ского экспериментального исследования многообразием, большим количеством применяемых методик для рассмотрения единичного случая.

Основа клинической диагностики — это развертка явлений во времени, и только комплекс методических приемов позволяет это сделать.

Клиническая диагностика, таким образом, строится на обобщении различных исходных данных интенсивного обследования единичного случая, а сама диагностика исходит из принципа качественного анализа особенностей психического явления в противоположность задаче лишь количественного измерения.

Эффективность работы клинического диагноста определяется его способностью выдвигать гипотезы, предположения и намечать воз­можные методы их проверки.

К наиболее распространенным клиническим диагности­ческим методам относится метод беседы.

Беседа— метод получения информации на основе вербальной (словесной) коммуникации. Беседа как диагностический метод по­зволяет получить информацию о внутренних процессах, субъектив­ных переживаниях и особенностях поведения человека, которые немогут быть обнаружены с помощью объективных методов. Беседа служит особым средством установления тесного личного контакта с собеседником и часто используется не только как диагностический метод, но и как психотерапевтический прием.

Установление позитивных личных отношений между участниками беседы требует специальной «технологии» ее проведения, в которую входят организация места,.контроль за состоянием самого диагноста и умение расположить к себе собеседника, используя приемы лич-ностно-ориентированной психотерапии (К. Роджерс, В.Н. Мясищев, Б.Д. Карвасарский). Результативность беседы как метода клиниче­ской диагностики зависит от уровня профессиональной компетенции практического психолога, а также от его личностных свойств, та­ких, как коммуникабельность, «направленность на другого», эмпатия, тактичность. Необходимы также наблюдательность и достаточ­но высокий уровень рефлексии, позволяющие лучше ориентировать­ся в ситуации общения и помогающие в каждом конкретном случае учесть индивидуальные особенности собеседника и выбрать опти­мальную тактику взаимодействия с ним (Е.Е. Данилова, 1990).

Метод наблюдениякак один из основных в клинической диаг­ностике состоит в преднамеренном, организованном, систематиче­ском и целенаправленном восприятии, изучении психических явле­ний с целью отыскания их смысла, если его невозможно воспринять непосредственно.

Наблюдение может сопровождать любой другой диагностический метод: наблюдение во время тестирования, в процессе ведения бе­седы и т.д.

Как самостоятельный диагностический клинический метод на­блюдение включает систему специальных приемов, обеспечивающих наибольшую информативность и точность наблюдения.

Метод наблюдения будет содержательным, если он организуется как целевое наблюдение. Наличие цели сужает поле наблюдения, но помо­гает систематизировать наблюдаемые факторы. Четко сформулирован­ная цель позволяет объективизировать изучаемые явления.

Положительной стороной наблюдения является то, что оно по­зволяет изучить психические явления в их естественном возникно­вении, течении, изменении, т.е. в том виде, как они происходят в действительности, в повседневной жизни. Это и есть непременное методическое условие его правильной организации.

Для того чтобы использовать все преимущества этого метода, клинический диагност должен систематизировать процесс наблюде­ния с помощью различных схем, карт, образцов.

В качестве примера можно привести Карту наблюдений Д. Стот-та, которая используется в работе практических психологов. В ос­нове этой методики лежит фиксация форм дезадаптированного по­ведения школьников на основе длительного наблюдения.

Наблюдение как клинический метод предполагает высокий уровень теоретических знаний и большой опыт практической деятельности клинического психолога, которые помогают избежать некоторой субъ­ективности в духе ожиданий наблюдателя при интерпретации фактов.

Созданию более точной картины индивидуальных особенностей способствует использование сведений об истории жизни человека, или так называемый анамнез. Иначе этот метод можно назвать био­графическим, т.е. предусматривающим сбор данных о биографии человека. Различие состоит в том, что об анамнезе диагносты гово­рят в связи с различного рода заболеваниями, ставя задачи выявле­ния их истоков. Биографический метод также служит задаче оты­скания причин того или иного психического изменения. Чаще всего биографический метод можно использовать в работе со школьника­ми в виде сочинений на заданную тему, в форме психологических самоописаний («Кто я?»). Биографический метод используется как дополнительный при групповой психотерапии, помогая выяснить природу и механизмы психогенных расстройств.

К вышеописанным методам тесно примыкает метод анализа продуктов деятельности человека[5].Этот метод дает богатый психологический материал, хотя зачастую его использование ос­ложнено вследствие неформализуемости показателей и субъектив­ности интерпретации результатов.

В клинической диагностике используется тестирование.Сама процедура тестирования закладывает стандартизированное измере­ние любой индивидуальной характеристики. Тестирование позволя­ет с известной вероятностью получить объективные показатели лю­бого психического процесса. Правда, следует иметь в виду, что да­же самые надежные тесты, валидность которых доказана, не дают точных данных для диагностики отдельных случаев. Однако воз­можность повторного применения тестирования позволяет обнару­живать различные проявления и изменения в течении болезни.

Особенность применения тестов в клинической диагностике со­стоит в том, что само тестирование проводится в индивидуальном варианте. Это в свою очередь поднимает вопрос о процедуре прове­дения самого теста и о возможности сопоставления результатов.

В патопсихологии тестирование часто используется для того, чтобы обнаружить не только структуру измененных, но и остав­шихся сохранными психических характеристик или проявлений.

В клинической диагностике применяются достаточно разнообразные тесты. Довольно часто используются такие индивидуальные тесты интеллекта, как тест Векслера, тес­ты Бине, пробы Крепелина, таблицы Шульте, метод иссле­дования афазий К. Гольдштейна и др.

Личностные тесты, используемые в клинической диагностике, в большинстве своем принадлежат к типу прожективных — тесты Роршаха, Тест тематической апперцепции (ТАТ), детский тест на апперцепцию (CAT), тест Розенцвейга, Тест на завершение неза­конченных предложений и др.

Психологи-клиницисты используют результаты тестирования для сопоставления со стандартными показателями, чтобы установить степень их расхождений. Это подводит психолога-клинициста к возможности вычисления «индекса ухудшения», получаемого в виде разницы между сравниваемыми величинами.

Практика использования комплекса методических приемов в клини­ческой диагностике имеет свой смысл и свое обоснование. Клиническая диагностика строится как оперативная, быстрая диагностика и, как правило, завершается написанием клинического заключения.

Проблема соблюдения принципа обратной связи в диагностике — это глобальная проблема, и относится она не только к клиническо­му диагностированию. В данном случае эта проблема выступает как наиважнейшая.

Оперативность вмешательства в «единичный случай» требует особо быстрого упорядочивания результатов обследования и уточ­нения собственных представлений о его качественном своеобразии. Иногда заключение может быть представлено в устной форме при завершающем разговоре с клиентом. Но чаще от психологов-клиницистов требуется письменное заключение. Письменное за­ключение представляет собой конечный этап обобщающих диагностических действий клинициста.В содержание заклю­чения необходимо включать все доступные психологу-диагносту данные как тестовые, так и иные.

Многочисленные психологические работы содержат множество практических советов по написанию заключения и позволяют сфор­мулировать некоторые важные принципы. (А. Анастази).

1. Содержание и стиль заключения зависят от теоретических ус­тановок и специализации диагноста-клинициста. Поэтому они не имеют единой стандартной формы и правила написания. Важно, чтобы заключение соответствовало потребностям, интересам и уровню подготовки тех, кто его получит. Например, учителя пред­почитают заключения с конкретными рекомендациями, а психиат­рам нравятся заключения с объяснением основных данных, но без конкретных рекомендаций.

В заключениях, рассчитанных как на специалистов, так и на лю­дей несведущих, должна даваться краткая аннотация содержатель­ного характера, а вслед за этим приводиться более подробное опи­сание конкретных данных.

2. В содержании заключения обязательно должна быть обозначе­на цель диагностического исследования: входило ли в задачу дать какие-то конкретные рекомендации или же требовалась простая консультация.

3. Заключение обычно ориентируется на действие, т.е. в нем да­ется рекомендация относительно программ обучения, типа лечения, выбора профессии и т.п.

4. Заключение эффективно, если в нем отражены отличительные свойства конкретного индивида, т.е. черты, результаты обследова­ния которых были или значительно ниже, или значительно выше средних показателей. То есть заключение должно относиться только к данному индивиду, а не к людям, чей возраст, пол, образование, социально-экономический уровень и другие факторы близки к ана­логичным данным обследуемого.

5. Содержание заключения состоит из интерпретации полученных данных и выводов (записи тестов и другие данные могут прилагать­ся отдельно для иллюстрации или пояснения подхода).

6. Всякая описательная оценка действий индивида и сама система оценок должны быть четкими. В заключении необходимо отметить, ос­новываются ли суждения об индивиде на критериально-ориентиро­ванной оценке или на нормативно-ориентированной, обязательно ука­зав, с какими нормами сравниваются показатели индивида.

Завершая рассмотрение основных положений клинической диагно­стики, хочется еще раз напомнить о том, что результаты клинических испытаний могут быть использованы в разных целях и предназначаться разным специалистам или самому клиенту и его родным.

Адресатами результатов клинической диагностики могут быть врачи, дефектологи, родители или сам клиент.

В зависимости от целей результаты клинической диагностики оформляются в виде заключения, рекомендаций или служат основой построения консультирования.

Литература

Анастази А. Психологическое тестирование. М., 1982. Т. 2. С. 97—121.

Вопросы практической психодиагностики и психологического консультиро­вания в вузе / Под ред. Н.Н. Обозова. Л., 1984.

Данилова Е.Е. Беседа как один из методов работы школьного психолога // Активные методы в работе школьного психолога. М., 1990.

Зейгарник Б.В. Введение в патопсихологию. М., 1978.

Карвасарский Б.Д. Психотерапия. М., 1985.

Глава XI
КРИТЕРИАЛЬНО-ОРИЕНТИРОВАННОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ (КОРТ)

Критериально-ориентированное тестирование — новое направле­ние в диагностике умственного развития учащихся. Основанные на особых способах конструирования и обработки методики КОРТ приобретают все большее значение в современной школе. Для по­строения заданий в КОРТ используется материал учебных программ — из него отбираются учебные задания, отвечающие определенным требованиям: задания должны репрезентировать внутренне завер­шенную область какого-то учебного предмета. Далее необходимо, чтобы задание могло быть представлено как логическая последова­тельность умственных действий, приводящих к его выполнению. Это задание при его выполнении должно вводить в мышление уча­щихся новые термины, понятия, ситуации и способствовать уста­новлению связей и отношений между ними и тем, что уже было ус­воено ранее. Такие задания называют ключевыми.

Овладение содержанием ключевого задания выступает в КОРТ в качестве критерия умственного развития учащихся в той специфи­ческой области, к которой принадлежит это задание; уровень раз­вития тем выше, чем полнее овладевают учащиеся его содержани­ем. Сложились два вида критериев.

Первый — критерий как показатель учебных достижений. Он обобщает ключевые задания из тех разделов учебных программ, изучение которых уже завершено. Сравнивая результаты, получен­ные при испытании методиками КОРТ, с критерием, устанавливают уровень умственного развития отдельного учащегося или группы учащихся. Разумеется, что этот уровень развития относится к той специфической области, которую представляет критерий.

Второй вид — критерий как показатель логико-психологической подготовленности учащегося к выполнению ключевых заданий из состава разделов программы, которые предстоит изучать. Критерий этого вида предназначен для того, чтобы установить, соответствует ли умственное развитие учащегося требованиям, предъявляемым новым программным материалом. И в этом случае результаты испытаний методиками КОРТ при их сравнении с критерием дадут ин­формацию о том, представлены ли в мышлении учащегося необхо­димые для усвоения новых разделов программы умственные дейст­вия, может ли он уверенно использовать, актуализировать их при выполнении новых ключевых заданий.

При анализе этой информации нужно считаться с тем, что уро­вень умственного развития учащихся может выявить недочеты ло­гико-психологической структуры тех разделов учебной программы, которые уже изучены и должны бы были подготовить учащихся к восприятию и усвоению нового материала.

По отношению к отдельным учащимся полученная по результа­там испытаний методиками КОРТ информация после ее психологи­ческого анализа позволяет установить пробелы и недостатки в их умственном развитии и построить систему коррекционных занятий, направленных на его приближение к критерию.

методы лабораторной диагностики разных заболеваний

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

На заметку




Слово «Прион» предложено в 1982 году американским врачом, профессором неврологии и биохимии Университета Калифорнии в Сан-Франциско Стенли Прузинером. Это особый класс возбудителей, состоящих их белка. Вызывают такие болезни, как болезнь Крейтцфельда — Якоба, куру, фатальная семейная бессонница.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический


. Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический


. Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический


. Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический


. Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

Диагностика вирусных инфекций

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование


. Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование


для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы


. Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Справка




Вирусные включения представляют собой выявляемые с помощью микроскопа образования в клетках, которые возникли при внедрении в организм вируса.

Методы диагностики протозойных инфекций

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический


. Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный


. Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический


. Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический


. Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Диагностика грибковых инфекций

Грибковые инфекции распространены не так широко, как вирусные или бактериальные потому, что они поражают в основном людей с ослабленным иммунитетом. Обычно при словах «грибковая инфекция» люди думают о заболеваниях кожи и ногтей, но сфера деятельности микозов шире: они могут поражать практически любые ткани. Самые распространенные грибковые поражения – это кандидоз, или молочница, микозы стоп, аспергиллез. При диагностике грибковых инфекций чаще всего используются следующие лабораторные методы:

Микроскопическое исследование


. Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный


. Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический


. Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот


. Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Методы и средства технического диагностирования

Для оценки диагностических признаков и заключения о техни­ческом состоянии оборудования используют различные методы.

Методы диагностирования классифицируют в зависимости от характера и физической сущности распознаваемых признаков и измеряемых параметров технического состояния объектов.

Акустические методы технического диагностирования, осно­ваны на измерении амплитуды и частоты звуковых колебаний, излучаемых объектом в процессе работы. Изменение техническо­го состояния элементов машин в процессе работы — увеличение зазоров в сопряжениях, изменение нагрузочного, скоростного и теплового режимов работы деталей вследствие их изнашивания, старения, коррозии вызывает соответствующие изменения пара­метров звуковых колебаний. Сопоставляя эмпирические значения звуковых сигналов с эталонными, можно судить о техническом состоянии объекта в данный момент времени и прогнозировать его изменение на некоторый период.

Поскольку в формировании звукового потока участвуют практи­чески все подвижные объекта диагностирования, акустические мето­ды позволяют оценить техническое состояние большинства основ­ных элементов по величинам излучаемых ими звуковых сигналов. Основная сложность при этом состоит в выделении определенного сигнала из общего спектра и распознавании его принадлежности тому или иному элементу машины. Для оценки звукового сигнала (выделения его из общего спектра и измерения) используют специ­альную аппаратуру — спектрометры, шумомеры, осцилографы.

Акустические методы диагностирования применяют в основ­ном для оценки технического состояния элементов, силовых уста-новок, механических и гидромеханических передач.

Виброметрическиеметоды основаны на измерении парамет­ров вибрации объекта диагностирования. Уровень вибрации объекта в процессе работы определяют техническим состоянием его основных элементов: размерами зазоров в сопряжениях, изно­сом деталей. Поэтому, измеряя параметры вибрации (частоту, амплитуду, ускорение) и сравнивая их с эталонными значениями, можно оценивать техническое состояние объекта диагностирова­ния в данный момент времени и прогнозировать его изменение на некоторый период.

Рис.21. Блок-схема виброметрической аппаратуры.

Приведенная на рис.21 блок-схема иллюстрирует устройство и принцип действия виброметрической аппаратуры. Установленный непосредственно на поверхности объекта датчик 1 регистри­рует механические вибрационные колебания и передает соответ­ствующие электрические сигналы на усилитель-анализатор 2. Кас­кад электронных интеграторов обеспечивает измерение амплиту­ды, скорости и ускорения механических колебаний. Набор частот­ных фильтров 3 позволяет настраивать прибор на соответствую­щий рабочий частотный диапазон. Кроме того, фильтры служат для подавления помех, обусловленных низко- и высокочастотны­ми шумами. Запись сигнала производят с помощью самописца 4 или какого-либо другого регистрирующего прибора (например, измерительного магнитофона), подключаемого на его место.

Поскольку параметры вибрации, используемые в качестве ди­агностических, являются широко информативными и формируют­ся под воздействием большого количества элементов объекта, ос­новной сложностью при диагностировании виброметрическими методами является, как и в предыдущем случае, распознавание принадлежности сигнала определенному элементу.

Виброметрические методы используют для диагностирования элементов силовых установок, механических и гидромеханичес­ких передач.

Методы технического диагностирования по составу масел наи­более универсальны и широко применяются для экспресс-оценки состояния двигателей, элементов трансмиссии, гидравлических систем управления, а также смазочных материалов и рабочих жидкостей.

Основными диагностическими параметрами в этих случаях яв­ляются концентрация, дисперсионный и элементарный составы механических примесей, кинематическая вязкость масла, кислот­ное и щелочное числа, а также содержание в масле воды.

Для анализа содержания механических примесей в масле ис­пользуют химический, спектральный, радиометрический, активационный и оптико-физические методы.

Функциональные методы диагностирования основаны на из­мерении косвенных параметров объекта, характеризующих техни­ческое состояние его элементов через уровень функционирования. В зависимости от характера распознаваемых признаков измене­ния технического состояния объекта диагностирование функцио­нальными методами может производиться по мощностным и тех­нико-экономическим показателям, тепловому состоянию, герме­тичности рабочих объемов, тормозному пути.

Метод оценки технического состояния машин по мощностным и технико-экономическим показателям используют как для обще­го, так и для углубленного поэлементного диагностирования. В основе метода лежат зависимости эффективности использования машины от технического состояния ее основных элементов. В ка­честве диагностических параметров в этом случае используют эф­фективную мощность двигателя, силу тяги, рабочую скорость, грузоподъемность. В зависимости от характера измеряемых диаг­ностических параметров подбирают соответствующее диагности­ческое оборудование.

Методы диагностирования машин по тепловому состоянию и герметичности рабочих объемов имеют более узкую область при­менения. Их в основном используют для оценки технического со­стояния элементов двигателей и гидросистем.

Поскольку ни один из перечисленных методов не позволяет произвести полную оценку технического состояния машины, при углубленном техническом диагностировании часто используют комбинированные виброакустические методы и совокупность функциональных методов.

Средства технической диагностики оборудования для различ­ных методов диагностики приведены в табл.5.

Похожие статьи:

Диагностические методы исследований — виды и особенности

Часто люди задают вопрос, какой метод диагностики самый точный? Можно ли однозначно на него ответить? Для этого давайте посмотрим, а какие вообще существуют диагностические методы.

Не углубляясь в медицинские термины, можно разделить все диагностические методы исследований на три группы.

К первым отнесем анатомические, то есть те исследования, которые используют визуальное наблюдение какого-либо органа. К ним относятся: рентген, флюорография, УЗИ, компьютерная и магнитно-резонансная томография, эндоскопия, лапароскопия. Сюда же можно отнести и визуальный осмотр врачом пациента: осмотр языка, горла, кожного покрова и т.д.

Все эти исследования объединяет следующее. Врач видит орган, его размер, положение, форму и анатомические дефекты (камни, кисты, язвы, опухоли, гнойники…)

Ко второй группе отнесем все лабораторные методы исследований. Они исследуют химические и физические процессы в нашем организме и выявляют отклонения на этих уровнях.

Например, УЗИ поджелудочной железы ничего не выявило, а анализ крови показал повышение уровня глюкозы в крови. Значит, мы уже можем диагностировать нарушение, причем на ранней стадии.

Третья группа диагностических исследований – методы функциональные, то есть те, которые определяют, нормально ли орган выполняет свою функцию. Из всем известных к этой группе относятся ЭКГ (работа сердца) и ЭЭГ (работа мозга), хотя электрический импульс можно снять практически с любого органа.

Болезни не появляются за один день, они развиваются годами и проходят несколько стадий.

Сначала нарушение работы (функции) органа незаметно, мы не чувствуем проблем, анализы в норме, снимки тоже.

Затем могут появиться неприятные симптомы — чуть покалывает, потягивает и то не всегда. Через несколько лет отражение нарушения функции органа мы увидим в результатах анализов. Если и здесь не принять никаких мер, то еще через какое-то время проблему увидим визуально, то есть на УЗИ, КТ, МРТ и при прочих анатомических исследованиях.

Например, сначала тянет подвздошную область, затем появляются признаки воспаления в анализах, затем обнаруживаем кисту в яичнике.

Теперь вернемся к основному вопросу статьи – есть ли единственный, самый точный метод диагностики? Наверно, уже понятно, что нет. Разные нарушения в организме фиксируются разными методами. И конечный диагноз (не только заболевание, но и его стадию) можно поставить только по результатам совокупности исследований. И одни методы не заменяют другие.

Также понятно, что чем раньше обнаружим проблему, тем легче ее решить. Поэтому не следует пренебрегать рекомендациями медиков, проводить исследования с некоторой периодичностью. А также не забывать реализовывать свое право раз в 3 года проходить диспансеризацию, которая как раз и поможет выявить недуги на ранней стадии, а следовательно предотвратить развитие серьезных заболеваний.

Какие методы диагностики доступны?

Диагностика и мониторинг хронических патологий печени зависят от клинических обследований, биологических исследований, гистологии, основанной на пункции биопсии, и неинвазивных методов визуализации, таких как ультразвук и пульсовая эластография.

Как мы видели, прогрессирование фиброза и стеатоза печени вначале полностью бессимптомно и может незаметно перерасти в цирроз. Это изменение происходит в течение нескольких лет.Затем цирроз может быть обнаружен случайно во время клинического обследования, или по отклонениям в результатах запланированных тестов печени, или при возникновении осложнения.

Клинический осмотр при отсутствии цирроза часто выявляет очень мало, за исключением, возможно, «печени пьющего» (гепатомегалии) при пальпации. При циррозе печени клиническое обследование может выявить: желтуху, признаки недостаточности печени (невусы крови, ладонный эритроз, печеночная энцефалопатия), признаки портальной гипертензии (коллатеральное венозное кровообращение, увеличение селезенки) и асцит, который может быть признак цирроза печени.

Биологические тесты могут выявить отклонения, но они появляются только при циррозе печени. Есть вероятность анемии или тромбопении. Уровень билирубина, щелочной фосфатазы и GGT может быть повышен. Отношение протромбина (PR) и фактор V могут быть низкими, что указывает на печеночную недостаточность. Понижение уровня белка будет способствовать появлению асцита. Для случаев гепатита С без сопутствующей патологии HAS (Французское управление здравоохранения) рекомендует использовать неинвазивные биологические тесты, такие как FibroMeter ™.FibroMeter ™ — это неинвазивный диагностический тест, который оценивает уровень фиброза в печени на основе дозирования нескольких биологических параметров. Он дает оценку от 0 до 1, соответствующую вероятности значительного фиброза или цирроза только для одного образца крови. Эти неинвазивные биологические тесты должны назначаться и интерпретироваться специалистами, поскольку на их результаты могут влиять другие факторы, такие как воспаление и т. Д.

УЗИ брюшной полости используется для оценки однородности паренхимы печени, которая может оказаться гиперэхогенной в случае стеатоза.Печень может иметь увеличенный объем и может иметь более или менее деформированные контуры. Могут быть видны признаки портальной гипертензии (расширение вен, спленомегалия, коллатеральное кровообращение).

До недавнего времени биопсия печени была пробным методом диагностики и количественной оценки паренхимы печени. Это инвазивное обследование не лишено недостатков или даже рисков: 20% испытуемых находят его болезненным, в 0,1% случаев наблюдаются осложнения кровотечения, и это приводит к смерти 0.01% пациентов. Поэтому повторять нелегко. Более того, он подвержен изменчивости от одного оператора к другому и от одной процедуры к другой, а также ошибок выборки. Наконец, это дорогостоящее обследование.

Переходная эластография с контролем вибрации или FibroScan® (VCTE ™) — это запатентованная технология Echosens ™. Он используется для неинвазивного измерения жесткости печени, которая является эффективным маркером качества паренхимы печени. Жесткость в физическом смысле этого слова — это способность материала деформироваться при приложении к нему механической нагрузки.Он выражается в килопаскалях (кПа) и увеличивается с увеличением жесткости среды. В физиологии человека это зависит от патологического состояния тканей. Чем тверже печень, тем больше степень фиброза.
CAP ™ (параметр контролируемого ослабления) позволяет количественно оценить стеатоз печени. Это новая технология, дополненная FibroScan® (VCTE ™), которая измеряет затухание ультразвуковых волн, которое, в первую очередь, зависит от вязкости среды, в которой они распространяются, и, следовательно, от избытка жира в печени (стеатоз).Величина затухания ультразвука, связанная с процентом стеатоза, выражается в децибелах на метр (дБ / м).

В повседневной практике оба измерения (фиброза и стеатоза) выполняются одновременно с помощью зонда, помещенного на кожу пациента. Эта операция повторяется до тех пор, пока не будет получено 10 достоверных измерений. Затем устройство вычисляет среднее значение жесткости (коррелированное с фиброзом) и среднее значение затухания ультразвука (коррелированное с процентом стеатоза), что обеспечивает немедленные одновременные результаты.Весь экзамен занимает менее 10 минут.

Frontiers | Усовершенствованные методы диагностики заболеваний растений на основе ДНК

Введение

Сельское хозяйство оценивается в 1500 миллиардов долларов США в год (Agrios, 2005). Однако значительный объем сельскохозяйственной продукции ежегодно теряется из-за множества заболеваний, и эта проблема особенно остро стоит в развивающихся странах (Agrios, 2005; Strange, 2012), что делает борьбу с болезнями сельскохозяйственных культур приоритетом в экономике, основанной на сельском хозяйстве.В случаях, когда устойчивые сорта отсутствуют, лучшим вариантом является выявление присутствия патогенов в поле как можно раньше и, таким образом, избежание возникновения болезни. Следовательно, эффективность многих комплексных стратегий борьбы с вредителями во многом зависит от наличия быстрых, чувствительных и специфических методов диагностики. Поэтому важно разработать более эффективные технологии для обнаружения болезней сельскохозяйственных культур и эффективно связать их с органами принятия решений, чтобы эффективно применять необходимые меры реагирования и защищать сельскохозяйственные системы.

Многие методы были разработаны для идентификации патогенов растений (Punja et al., 2007). Самые ранние традиционные методы использовали наблюдение за симптомами, включая полевые осмотры для выявления симптомов болезни, а также лабораторные тесты, такие как культивирование патогенов на селективных средах с последующими физиологическими, биохимическими тестами и тестами на патогенность (Horsfall and Cowling, 1977). Хотя обычные методы надежны, они требуют много времени и требуют от опытных патологов для определения патогена, ответственного за заболевание.Эти причины сделали желательным разработку методов обнаружения с более высокой чувствительностью, специфичностью и скоростью для идентификации патогенов растений.

Технология антител

используется в диагностике растений с 1980-х годов, и было опубликовано множество обзоров по этой технологии (Alvarez, 2004; Narayanasamy, 2011). Методы диагностики на основе антител для обнаружения патогенов растений стали популярными и мощными инструментами из-за их скорости, чувствительности и недорогой природы. Однако поликлональные антитела (PAb) против патогенов растений, продуцируемые иммунизацией животных, могут проявлять перекрестную реактивность с неродственными патогенными видами из-за их ограниченной специфичности (Macario and Conway de Macario, 1985).С разработкой моноклональных антител (MAb) специфичность была улучшена, поскольку они нацелены на единственный эпитоп в патогенном белке (Thornton, 2009). Следовательно, используются различные методы диагностики на основе антител, такие как иммуноферментный анализ (ELISA) (Comstock, 1992; Kokoskova and Janse, 2009), иммуноблоттинг (Novakova et al., 2006), иммунофлуоресцентный тест (Malin et al., 1983) и устройства с боковым потоком (LFD) (Tomlinson et al., 2010d) были разработаны и широко используются для идентификации патогенов растений.Однако получение MAb дорого, и сообщалось, что близкородственные виды могут иметь общие эпитопы и вызывать положительную реакцию MAb (Teitelbaum et al., 1991; Gorris et al., 1994).

Появление в 1980-х годах полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило ученым исследовать и разработать основанные на ДНК подходы для обнаружения патогенов растений. В результате появились сообщения о многих диагностических методах на основе ПЦР для идентификации патогенов растений (Ward et al., 2004; Vincelli and Tisserat, 2008).Кроме того, было описано усиление патоген-специфических последовательностей и сочетание ПЦР с другими методами для повышения специфичности и чувствительности (Merighi et al., 2000; Brasileiro et al., 2004; Carrasco-Ballesteros et al., 2007 ). Например, высокоспецифическая ПЦР-иммунозахват (IC-PCR) использовалась для обнаружения вирусов, комбинируя обычную амплификацию PCR с вирусными частицами, захваченными антителами. Этот подход повысил чувствительность в 250 раз по сравнению с прямой амплификацией ПЦР (Wetzel et al., 1992), что позволяет успешно выявить бактериальный ожог в материале для размножения антуриума ( Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae ) (Khoodoo et al., 2005).

Комбинация общепринятой ПЦР и иммуноферментного анализа (ELISA), названная PCR-ELISA, была разработана в начале 1990-х годов (Nutman et al., 1994). Анализ включает гибридизацию меченого продукта ПЦР с иммобилизованным зондом на планшете для ELISA с последующим добавлением ферментного конъюгата и субстрата для анализа захваченного продукта ПЦР с использованием фотометрических измерений.Этот анализ позволил выявить одну популяцию ампликонов среди нескольких других, которые были созданы в мультиплексной реакции (Laitinen et al., 2002). Этот метод успешно использовался для обнаружения вирусов (Shindo et al., 1994), бактерий (Daly et al., 2002) и грибов (Bailey et al., 2002; Somai et al., 2002) с более высокой специфичностью, чем обычная ПЦР. . Однако, несмотря на свою высокую специфичность, анализ дал ложноположительные результаты при обнаружении Neisseria meningitides (Borrow et al., 1998) и Mycobacterium tuberculosis (Kent et al., 1995; Gillespie et al., 1997), поскольку было обнаружено, что ДНК, амплифицированная ПЦР, гибридизуется с зондом ELISA от других видов.

Важное улучшение в методах диагностики на основе ДНК произошло с разработкой количественной ПЦР в реальном времени, которая позволила не только обнаруживать присутствие патогенов, но и количественно определять уровни патогенов в образцах тканей, таким образом позволяя определять тяжесть патогенной инфекции ( Heid et al., 1996). Недостатком этой технологии является необходимость в дорогостоящем оборудовании и реагентах, что ограничивает ее использование в качестве быстрого и экономичного метода диагностики. Кроме того, высокая чувствительность анализа увеличивает риск обнаружения даже небольших количеств загрязнения в реагентах или биологических образцах, что приводит к диагностике ложноположительных результатов, что создает необходимость в этапах нормализации или прогонах предварительного считывания, чтобы гарантировать точность результатов (Вонг и Медрано, 2005; Новрузиан и др., 2009).

Хотя анализы на основе ПЦР улучшили чувствительность и использовались для множественного обнаружения патогенов (Price et al., 2010; Araujo et al., 2012; Dai et al., 2013), анализы по-прежнему подвержены неспецифической ДНК. амплификация, приводящая к ложноположительным результатам при выполнении множественного обнаружения неизвестных патогенов в тканях больных растений (Markoulatos et al., 2002; Sint et al., 2012).

Тестирование на патогены растений в месте оказания медицинской помощи

Диагностические анализы на месте (POC), которые не требуют сложного оборудования и могут быть быстро и дешево выполнены в полевых условиях, пользуются большим спросом (Yager et al., 2006). Методы, основанные на ПЦР, имеют множество преимуществ перед другими технологиями, но требуют подачи электричества для выполнения температурных изменений, необходимых для амплификации ДНК; серьезно ограничивает его пригодность для приложений POC (Barany, 1991). В качестве альтернативы методы изотермической амплификации ДНК идеально подходят для преодоления этого ограничения (Gill and Ghaemi, 2008; Craw and Balachandran, 2012). Например, изотермическая амплификация в сочетании с полосками с боковым потоком и портативными флуорометрами успешно использовалась для обнаружения патогенных ДНК в точках контакта (Notomi et al., 2000; Винсент и др., 2004; Пипенбург и др., 2006; Чоу и др., 2008; Lutz et al., 2010; Махаланабис и др., 2010; Рорман и Ричардс-Кортум, 2012). Тем не менее портативные флуорометры дороги и необязательно подходят для использования в полевых условиях, подверженных неблагоприятным погодным условиям, что ограничивает их широкое распространение. Технология диагностического анализа POC, объединяющая весь процесс от подготовки образца до визуализации результатов, все еще не доступна. Сельскохозяйственная промышленность могла бы получить большую выгоду от наличия удобных и дешевых анализов POC, поскольку поля сельскохозяйственных культур могут находиться далеко от аналитических лабораторий, а транспортировка образцов может создавать логистические проблемы.

Методы выделения ДНК на месте

Эффективный метод извлечения ДНК POC необходим для разработки быстрых и удобных для пользователя молекулярных диагностических тестов, но отбор проб в полевых условиях редко обсуждается при описании методов диагностики на основе ДНК. Эта нетривиальная задача — постоянно генерировать фиксированную входную ДНК хорошего качества (т. Е. Без потенциальных ингибиторов) имеет последствия для любых анализов. При работе с тканями растений метод экстракции ДНК требует способности эффективно удалять ряд химических веществ, которые могут ингибировать реакцию амплификации ДНК (Ikeda et al., 2008).

Метод выделения ДНК LFD был признан быстрым и эффективным для тестирования POC и успешно использовался для обнаружения патогенов растений (Tomlinson et al., 2010a, b). Этот метод включает разрушение образца в буфере для экстракции с использованием металлических шарикоподшипников перед переносом лизата на высвобождающую подушку нитроцеллюлозной мембраны LFD. Затем вырезают небольшой кусок мембраны и добавляют в реакцию амплификации ДНК, такую ​​как ПЦР или другие методы изотермической амплификации.Изолированная ДНК очень стабильна на мембране при комнатной температуре, что позволяет проводить экстракцию в полевых условиях (Tomlinson et al., 2010a).

Твердофазная обратимая иммобилизация (SPRI) — еще один метод экстракции ДНК с потенциальным применением POC (Wee et al., 2015). Недавно сообщалось о недорогом процессе очистки ДНК / РНК с использованием обычных наконечников для пипеток с фильтром в сочетании с технологией SPRI (Deangelis et al., 1995) для последовательного извлечения ДНК / РНК до точной концентрации, которая может быть немедленно использована для последующей изотермической амплификации ( Wee et al., 2015). Магнитная экстракция на основе шариков SPRI идеально подходит для приложений POC, потому что единственное необходимое оборудование — это магнит и микропипетка. После мацерации диска с одним листом пластиковым пестиком в буфере для лизиса лизат растений очищали от клеточного мусора, пропуская лизат через фильтрованный наконечник пипетки. Затем ДНК очищали от лизата с использованием SPRI, и экстрагированную ДНК непосредственно использовали в реакции амплификации. Этот метод выделения ДНК использовался в различных диагностических целях, включая заболевания человека и растений (Ng et al., 2015; Wee et al., 2015).

В недавнем отчете описана разработка чрезвычайно простой индикаторной полоски на основе целлюлозы, которая позволяет обрабатывать образцы растений всего за 30 секунд (Zou et al., 2017). Растительные ткани мацерируют встряхиванием в пробирке с экстракционным буфером и 1-2 шарикоподшипниками в течение 8-10 с. Индикаторный стержень из целлюлозы вставляется в пробирку, содержащую образец, перед его трехкратной промывкой во второй пробирке, содержащей промывочный буфер, и, наконец, в пробирку, содержащую смесь для амплификации.Технология эффективно работает с множеством культивируемых видов, включая рис, пшеницу, помидоры и сорго, а также с печально известными сложными тканями, такими как листья взрослых деревьев (мандарин, лайм и лимон). Его можно использовать для обнаружения ДНК патогенов, а также РНК из инфицированных тканей, и он работает с несколькими методами амплификации, такими как ПЦР, LAMP и RPA. Прямые сравнительные исследования показали, что эта технология так же чувствительна, как и SPRI, но дешевле, быстрее и не требует каких-либо действий по дозированию.

Применение методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот в обнаружении болезней растений

Опосредованная ферментом in vitro амплификация нуклеиновых кислот стала важным инструментом в молекулярной биологии с 1980-х годов (White et al., 1989). ПЦР — один из наиболее широко используемых методов обнаружения и идентификации патогенов путем нацеливания на определенные последовательности в их геномной ДНК. Хотя ПЦР очень чувствительна и надежна, она ограничена рядом технических ограничений.Например, специфичность сильно зависит от используемых праймеров, а присущая ему чувствительность делает его склонным к ложноположительным результатам из-за перекрестного загрязнения образца. Кроме того, ПЦР также требует оборудования с электрическим приводом для выполнения термоциклирования, что ограничивает его использование для диагностики в местах оказания медицинской помощи. В настоящее время доступен ряд альтернативных изотермических методов, которые могут устранить необходимость в термоциклере, хотя каждый из них имеет свои сильные и слабые стороны.

ЛАМПА

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — это метод амплификации нуклеиновых кислот, разработанный Notomi et al.(2000). Он получил широкое распространение благодаря своей высокой эффективности, специфичности, простоте и быстроте. LAMP требует двух длинных внешних праймеров и двух коротких внутренних праймеров, которые распознают шесть специфических последовательностей в целевой ДНК. Первый внутренний праймер, содержащий смысловые и антисмысловые последовательности в ДНК, будет гибридизовать целевую последовательность и инициировать синтез ДНК (Рисунок 1; Tomita et al., 2008). Затем внешний праймер выполняет синтез ДНК со смещением цепи и производит одноцепочечную ДНК, которая работает как матрица для второго внутреннего и внешнего праймеров, производящих молекулу ДНК с петлевой структурой.Непрерывная циклическая реакция накапливает продукты с повторяющимися последовательностями целевой ДНК разных размеров.

РИСУНОК 1. Схематическое изображение опосредованной петлей изотермической амплификации (LAMP) (Tomita et al., 2008). (A) LAMP включает два набора праймеров для нацеливания на шесть различных областей. (B) Внутренний праймер, содержащий смысловую и антисмысловую последовательности целевой ДНК, гибридизуется с целевой последовательностью и инициирует синтез ДНК. Внешний праймер выполняет синтез ДНК со смещением цепи и производит одноцепочечную ДНК, которая работает как матрица для вторых внутренних и внешних праймеров для синтеза ДНК, которые гибридизуются с другим концом мишени с образованием петлевой структуры ДНК. (C) Из структуры двойной стебель-петля внутренний праймер связывается с петлей и синтезирует новую цепь. Удлинение праймера открывает петлю на 5′-конце, и снова внешняя цепь праймера замещает вновь образовавшуюся более длинную ДНК с образованием оцДНК с образованием петли ДНК. LAMP производит ДНК петлевой структуры различных размеров.

Петлевая изотермическая амплификация имеет три основных преимущества. Во-первых, его можно проводить при постоянной температуре с коротким временем реакции.Этот быстрый изотермический процесс делает его идеальным для обнаружения патогенов растений в полевых условиях (Fukuta et al., 2014) и используется для обнаружения вируса оспы сливы за 2,5 часа (Hadersdorfer et al., 2011). Во-вторых, он обладает очень высокой эффективностью и чувствительностью амплификации, поскольку генерирует большие количества продукта ПЦР с низким количеством входящей ДНК (Tomlinson et al., 2010c; Bhat et al., 2013). Наконец, этот метод относительно рентабелен, так как для проведения анализа требуется простое оборудование.Кроме того, были сообщения о том, что LAMP генерирует ампликоны с несколькими инвертированными повторами, которые потенциально могут быть использованы для повышения чувствительности в анализах гибридизации, таких как гибридизация LAMP-ELISA (Lee et al., 2014) и LAMP, объединенная с колориметрической гибридизацией наночастиц золота. зонды (Watthanapanpituck et al., 2014).

Хотя LAMP является идеальным изотермическим методом для обнаружения патогенов растений POC в полевых условиях, он имеет определенные ограничения. Во-первых, конструкция праймеров LAMP сложна и не интуитивно понятна, что затрудняет работу неспециалистов.Несмотря на то, что существует доступное программное обеспечение для создания праймеров LAMP, оптимальные характеристики праймеров не гарантируются, как это обычно бывает при ПЦР. Кроме того, ампликоны LAMP содержат смесь молекул ДНК «стебель-петля» разных размеров, которые не подходят для целей клонирования генов или для идентификации конкретных мишеней на основе различий в размерах. Однако ограничение размера было преодолено Nagamine et al. (2002), которые разработали модифицированный метод LAMP, который генерирует однородные и однонитевые ампликоны ДНК посредством расщепления Tsp RI перед расширением продуктов с использованием праймера для получения специфичных для цепи фрагментов ДНК.

Поскольку LAMP имеет потенциал для диагностических целей POC, несколько простых методов считывания были объединены с LAMP для замены традиционного гель-электрофореза для обнаружения присутствия ампликонов. В самых простых и дешевых методах используются индикаторы ионов металлов, такие как гидроксинафтоловый синий (HNB) или SYBR зеленый, в качестве красителей ДНК для визуализации конечных продуктов (Chen et al., 2012; Duan et al., 2014). Добавляя цветные индикаторы в реакцию LAMP перед амплификацией, продукты можно обнаружить невооруженным глазом с помощью простого колориметрического анализа.Используя этот метод считывания, можно было обнаружить всего 10 копий целевой ДНК (Chen et al., 2012). Колориметрическое считывание успешно использовалось для обнаружения невооруженным глазом вируса скручивания листьев картофеля и Fusarium oxysporum (Ahmadi et al., 2013; Zhang et al., 2013). Тем не менее, по нашему опыту, изменения цвета, вызванные вышеупомянутыми индикаторами, могут быть довольно незначительными, и, хотя их можно наблюдать в лабораторных условиях, их трудно обнаружить в полевых условиях из-за различных условий освещения при разных условиях. время суток.

Альтернативно, LAMP комбинируют с ELISA путем включения антиген-меченных нуклеотидов в ампликоны LAMP во время процесса амплификации. Затем полученные ампликоны гибридизуют со специфическими иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, которые затем анализируют с помощью иммуноанализа. Основным преимуществом LAMP-ELISA является его способность обрабатывать сотни образцов одновременно в течение нескольких часов (Ravan and Yazdanparast, 2012; Lee et al., 2014). Комбинация LAMP с ELISA обеспечивает очень высокую чувствительность с успешным обнаружением одной копии целевой ДНК (Lee et al., 2014). Однако этот метод требует квалифицированного труда, так как включает сложные этапы ELISA.

После использования оптических и колориметрических систем считывания электрохимические сенсоры, способные обнаруживать изменения сигнала, вызванные переносом электронов в двухцепочечной ДНК, были использованы для обнаружения присутствия амплифицированной ДНК (Ferguson et al., 2009). Интеграция LAMP с электрохимическим датчиком предоставила надежную платформу для обнаружения патогенов, поскольку он был высокочувствительным, обнаруживая всего 10 копий геномной ДНК патогена (Hsieh et al., 2012). Применение технологии LAMP-биосенсоров растет во всех областях, от клинической молекулярной диагностики до мониторинга окружающей среды, но ее применение все еще является довольно новым в обнаружении патогенов растений. Таким образом, технология LAMP-биосенсоров имеет большой потенциал для полевых испытаний, обнаружения и идентификации болезней растений.

HDA

Хеликаза-зависимая амплификация (HDA) — это альтернативный изотермический метод, разработанный New England Biolabs в 2004 году (Vincent et al., 2004). Этот изотермический метод очень похож на стандартный ПЦР, но он не требует тепловой денатурации для разделения двухцепочечной ДНК и позволяет праймерам отжигаться с ее комплементарными целевыми последовательностями. HDA использует ДНК-геликазу для создания одноцепочечной ДНК для отжига праймера с последующим удлинением праймера в изотермических условиях (рис. 2). Одноцепочечный связывающий белок (SSB) и эндонуклеаза MutL добавляют в реакцию, чтобы предотвратить повторную гибридизацию комплементарных цепей оцДНК для преобразования дцДНК.Детектируемые количества ампликонов ПЦР для последующего анализа обычно генерируются в течение 60 минут методом HDA (Vincent et al., 2004).

РИСУНОК 2. Схематическое изображение зависимой от геликазы амплификации (HDA). (A) Геликаза открывает дцДНК. (B) Праймеры отжигаются с последовательностями-мишенями. (C) Удлинение праймера ДНК-полимеразой. Вновь образованные дцДНК открываются геликазой, и процесс начинается снова. (D) Вновь образованные дцДНК открываются геликазой, и процесс начинается снова.

Зависимая от геликазы амплификация стала популярной изотермической техникой из-за простых стадий реакции. Хотя он амплифицирует целевые последовательности с использованием пары праймеров с использованием того же принципа, что и ПЦР, этапы намного проще, поскольку не требуют нескольких этапов циклического изменения температуры. Хотя LAMP и had являются изотермическими, для LAMP требуются четыре длинных праймера сложной конструкции, которые нуждаются в начальной стадии тепловой денатурации перед амплификацией при более низкой температуре (Nagamine et al., 2002). HDA успешно использовался для обнаружения геномной ДНК патогена, присутствующей в неочищенной смеси образцов крови человека с высокой чувствительностью (Vincent et al., 2004). Хотя характеристики HDA кажутся идеальными для разработки простых диагностических тестов на месте, основным недостатком является то, что он требует сложной оптимизации для обеспечения скоординированной активности ферментов между геликазой и ДНК-полимеразой.

Кроме того, присутствие SSB и MutL, которые необходимы для предотвращения повторной гибридизации оцДНК с образованием дцДНК, потенциально может значительно повлиять на конечные результаты (Vincent et al., 2004). Кроме того, есть некоторые сообщения, в которых говорится, что HDA неэффективен при амплификации длинных мишеней (Guatelli et al., 1990), вероятно, из-за того, что геликаза UvrD имеет ограниченную скорость раскрутки (20 п.о. / с) и обрабатывает менее 100 п.н. связывание (Ail et al., 1999). MutL способен усиливать активность разматывания UvrD, но не увеличивает скорость обработки (Mechanic et al., 2000). Значительное улучшение было сделано с открытием термостабильной UvrD-геликазы (Tte-UvrD) из Thermoanaerobacter tengcongensis , подходящей для амплификации при более высокой температуре (An et al., 2005). Использование Tte-UvrD позволяет проводить HDA при более высокой температуре, уменьшая повторный отжиг одноцепочечной ДНК и, следовательно, устраняя необходимость в SSB и MutL.

В настоящее время HDA широко используется в клинических применениях на людях, таких как диагностика Salmonella paratyphi (Faizul Rahman et al., 2014) и патогенов, вызывающих диарею (Huang et al., 2013; Eckert et al., 2014), а также в ветеринарии, например, при обнаружении Streptococcus equi , вызывающего удушение у лошадей (Artiushin et al., 2011). Однако его применение для обнаружения патогенов растений все еще ограничено и использовалось только для идентификации вируса лепроза цитрусовых C и вируса табачной мозаики (Corona et al., 2010). Для повышения чувствительности HDA была объединена с другими технологиями, такими как ELISA (Gill et al., 2007) и наночастицами золота (Gill et al., 2008) для обнаружения Helicobacter pylori . Результаты как HDA-ELISA, так и HDA-наночастиц показали повышение чувствительности и специфичности на 90% по сравнению с исходным анализом HDA.

RCA

Принцип изотермической амплификации также использовался для амплификации кольцевой ДНК в процессе, известном как амплификация по катящемуся кругу (RCA) (Fire and Xu, 1995). RCA включает использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи (такой как ДНК-полимераза ϕ29) для удлинения одиночного праймера, отожженного до кольцевой ДНК-матрицы. Активность замещения цепи позволяет вновь синтезированной ДНК замещать ранее созданную ДНК, высвобождая оцДНК (Blanco et al., 1989).Этот ферментативный процесс удлинения праймера в сочетании со смещением цепи генерирует длинную одноцепочечную ДНК, содержащую повторяющуюся последовательность, комплементарную кольцевой матрице (рис. 3).

РИСУНОК 3. Схематическое изображение усиления по катящемуся кругу (RCA). (A) Праймер, комплементарный области круглого зонда, отжигается с круглым шаблоном. (B) ДНК-полимераза инициирует синтез ДНК. (C) Смещение цепи позволяет продолжить синтез ДНК вдоль кольцевой матрицы. (D) Синтез ДНК продолжает генерировать продукт длинной оцДНК.

Усиление по катящемуся кругу предлагает простейший изотермический механизм реакции. При дополнительных манипуляциях линейная ДНК также подходит в качестве матрицы для реакции RCA. Линейный зонд оцДНК может быть сконструирован таким образом, чтобы его можно было первоначально гибридизировать с последовательностью-мишенью, образуя петлю, и лигировать с образованием кольцевого зонда перед выполнением RCA (рис. 4). Этот процесс, называемый анализом зонда с замком, использовался для обнаружения многих болезней растений (Szemes et al., 2005; Slawiak et al., 2013; Тиан и др., 2014). Высокий потенциал мультиплексирования и специфичность зондов с замком, за которыми следует RCA, также способствует его популярности в мультиплексном обнаружении патогенов растений. Кроме того, сообщалось, что RCA имеет более высокую специфичность и менее подвержен неспецифической амплификации, чем ПЦР. Еще одно преимущество метода RCA заключается в том, что он позволяет генерировать до 0,5 мегабаз ДНК на зонд в течение ночи инкубации (Baner et al., 1998) и генерирует 10 ⁹ или более копий каждого круга за 90 минут (Lizardi et al. al., 1998). Создание множественных копий повторяющихся последовательностей дает преимущество при считывании на основе гибридизации, когда повторяющиеся последовательности могут быть легко захвачены для повышения чувствительности (Gusev et al., 2001; Nallur et al., 2001; Russell et al., 2014). Кроме того, RCA устойчива или, по крайней мере, менее подвержена переносящемуся загрязнению продуктов амплификации, поскольку в процессе RCA не образуется новый 3′-концевой продукт оцДНК, который может быть потенциальным праймером для неспецифической амплификации (Kobori и Такахаши, 2014).

РИСУНОК 4. Анализ зонда Padlock с RCA. (A) Линейные зонды оцДНК содержат два сайта связывания как на 3 ‘, так и на 5’ концах для нацеливания на специфические последовательности. (B) Денатурация целевой последовательности дцДНК и гибридизация зонда оцДНК в направлении области-мишени, образующей петлю. (C) После лигирования с образованием круглого зонда праймер RCA связывается с целевой областью праймера и запускает RCA.

Амплификация по типу «вращающегося круга» широко используется для обнаружения патогенов растений с начала 2000-х годов.Несколько методов были использованы в сочетании с RCA, такие как полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) и прямое секвенирование, чтобы идентифицировать и классифицировать патогены растений эффективно со значительно меньшими усилиями и затратами, чем традиционные технологии (Schubert et al., 2007). Визуализация продуктов RCA невооруженным глазом с добавлением флуоресцентного красителя была использована для обнаружения более 40 штаммов Fusarium spp. (Davari et al., 2012). Лигирование зондов с замком с последующим RCA также было разработано для идентификации грибковых патогенов (Najafzadeh et al., 2011). Включение RCA с различными технологиями считывания, такими как микроматрицы, биосенсоры ДНК и иммунные анализы, значительно улучшило чувствительность по сравнению с гель-электрофорезом (Gusev et al., 2001; Nallur et al., 2001; Li et al., 2009; Ji et al., 2012; Russell et al., 2014). Хотя эти методы считывания кажутся идеальной альтернативой анализам на основе RCA, они дороги и включают сложные этапы по сравнению с простым мониторингом изменения цвета невооруженным глазом.

RPA

Амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) — еще один изотермический метод, который, как и HDA, не требует начальной стадии нагревания для денатурирования целевой ДНК (Piepenburg et al., 2006), поскольку он основан на ферментативной активности по разделению дцДНК, чтобы способствовать связыванию праймера с целевыми последовательностями. Реакция начинается с интеграции белка рекомбиназы с праймерами до их отжига с конкретными последовательностями в мишени. После отжига праймеров рекомбиназа отделяется от праймеров и оставляет их 3′-конец доступным для ДНК-полимеразы, чтобы инициировать амплификацию. Это создает d-петлю, которая стабилизируется одноцепочечным связывающим белком (SSB), чтобы ДНК оставалась открытой, пока ДНК-полимераза с активностью замещения цепи продолжает амплификацию (рис. 5).Используя RPA, миллиарды копий ДНК могут быть эффективно созданы за 60 минут при температуре инкубации от 37 ° C до 42 ° C (Piepenburg et al., 2006).

РИСУНОК 5. Схематическое изображение амплификации рекомбиназной полимеразы (RPA). (A) Рекомбиназа интегрируется с праймерами с образованием комплексов рекомбиназа-праймер и нацеленных на специфические последовательности ДНК. (B) Происходит обмен цепями, и одноцепочечные связывающие белки (SSB) связываются с ДНК с образованием D-петли. (C) ДНК-полимераза инициирует амплификацию ДНК. (D) Смещенная D-петля, стабилизированная SSB по мере продолжения усиления. (E) Формируются две молекулы дцДНК, и весь цикл начинается заново.

Низкая температура инкубации и короткое время реакции (15–30 мин) делают RPA подходящим анализом для использования в диагностических целях в местах оказания медицинской помощи. Кроме того, конструкция праймеров проста без учета температуры отжига, поскольку они образуют комплекс с рекомбиназой для нацеливания на гомологичные последовательности.RPA обладает высокой чувствительностью с пределом обнаружения всего 6,25 фг входящей геномной ДНК со специфичностью> 95% (Boyle D.S. et al., 2014).

Однако, как и другие обсуждаемые технологии, RPA имеет некоторые недостатки, поскольку он может амплифицировать только небольшие фрагменты ДНК (<500 п.н.), поэтому он не подходит в случаях, когда требуется амплификация полноразмерных генов. Кроме того, более длинные праймеры (30–35 нуклеотидов), необходимые для RPA, склонны к неспецифической амплификации при низкой температуре.Кроме того, праймеры, используемые в реакции RPA, часто создают высокий фоновый шум на отрицательных и нематричных контрольных образцах из-за образования димеров праймеров, что влияет на чувствительность анализа.

Недавно было опубликовано множество отчетов, описывающих клинические приложения на основе RPA (Boyle D.S. et al., 2014; Crannell et al., 2014; Kersting et al., 2014). Для растений был описан ряд приложений на основе RPA для обнаружения патогенов растений с высокой чувствительностью, специфичностью и экономической эффективностью.Комбинация обратной транскриптазы-RPA (RT-RPA) и бокового потока позволила успешно обнаружить небольшой вирус вишни из сырых экстрактов, что является более экономичным, чем RT-PCR, и более подходящим для условий с ограниченными ресурсами (Mekuria et al., 2014). RT-RPA также использовался для обнаружения вируса оспы сливы с более высокой чувствительностью, чем обычный ELISA и иммунополосный анализ (Zhang et al., 2014). RPA-ELISA был разработан для чувствительной, специфической и рентабельной идентификации патогенов растений (Santiago-Felipe et al., 2014). Анализ невооруженным глазом, который сочетает RPA с мостиковой флокуляцией магнитных шариков, был недавно разработан для эффективного выявления POC патогенов растений и человека (Ng et al., 2015; Wee et al., 2015). RPA, за которым следует электрохимический датчик ДНК в качестве считывающей платформы, был описан как новая технология для обнаружения патогенов растений (Lau et al., 2017). Этот RPA / электрохимический датчик в 10 000 раз более чувствителен, чем обычная полимеразная цепная реакция (ПЦР) / гель-электрофорез, и он успешно идентифицировал Pseudomonas syringae инфицированных образцов растений на ранней стадии заражения, прежде чем проявятся какие-либо симптомы.Учитывая, что RPA — это довольно новый изотермический метод, еще предстоит провести дополнительные исследования для обнаружения патогенов растений на месте.

Мультиплексное обнаружение патогенов растений

Разработка технологий с возможностью мультиплексного обнаружения — еще одна проблема в диагностике болезней растений, поскольку они более экономичны, сокращают время анализа и требуют минимального количества пробы. Обнаружение мультиплексирования с высокой пропускной способностью было успешно достигнуто с помощью ПЦР в реальном времени на платформе OpenArray ^TM (van Doorn et al., 2007), технологии иммуноанализа микросфер (Charlermroj et al., 2013) и микроматриц (Szemes et al., 2005). Однако все еще необходимы более простые, но эффективные методы множественного обнаружения, позволяющие идентифицировать несколько патогенов одновременно.

Зонды с молекулярной инверсией (MIP) обеспечивают экономичную мультиплексную диагностику и часто используются в клинических приложениях. MIP представляет собой длинный одноцепочечный зонд длиной более 100 нуклеотидов с двумя связывающими доменами на 5′- и 3′-концах (B1 и B2 на рисунке 6).Связывающие домены сконструированы так, чтобы быть комплементарными интересующей целевой области (рис. 6; Lau et al., 2014). Это позволяет MIP образовывать кольцевую петлю с одноцепочечным разрывом между двумя областями связывания. После отжига MIP ДНК-полимераза, лишенная 5′-3′-экзонуклеазы и активности замещения цепи, инициирует синтез ДНК с 3′-конца разрыва в реакции заполнения разрыва. Затем ДНК-лигаза используется для лигирования вновь синтезированной цепи и создания кольцевой молекулы ДНК.Для обеспечения чувствительности анализа выполняется стадия расщепления экзонуклеазой для удаления линейных зондов. Затем лигированные MIP амплифицируют в реакции ПЦР с использованием универсального набора праймеров, нацеленного на P1 и P2.

РИСУНОК 6. Схематическое изображение анализа MIP (Lau et al., 2014). MIP состоит из двух сайтов связывания на 3′- и 5′-концах (B1 и B2), которые комплементарны последовательностям-мишеням, и двух универсальных праймерных сайтов (P1 и P2). B1 и B2 гибридизуются со специфическими последовательностями на мишени с одноцепочечным разрывом между двумя связывающими областями. (A) Гибридизация: B1 и B2 связываются со специфическими последовательностями на целевой ДНК, создавая одноцепочечный разрыв между связывающими доменами MIP. (B) Заполнение промежутка: ДНК-полимераза, у которой отсутствует экзонуклеаза и активность замещения цепи, синтезирует ДНК от 3′-конца MIP до 5′-конца до тех пор, пока одноцепочечный разрыв не будет заполнен. (C) Лигирование: ДНК-лигаза лигирует 3′-конец и 5′-конец MIP, создавая кольцевую ДНК. (D) Переваривание: экзонуклеазы I и III расщепляют линейные MIP и ДНК-мишень в реакционной смеси, оставляя циркуляризованные MIP для амплификации. (E) Полимеразная цепная реакция (ПЦР): пара универсальных праймеров (P1 и P2) амплифицирует циркулярный MIP с использованием универсальных праймерсвязывающих доменов для генерации ампликонов ПЦР.

Очень мультиплексируемая природа зондов MIP, которые способны различать тысячи мишеней за одну реакцию, является основным преимуществом этого анализа. Связывающие домены на 3′- и 5′-концах связаны основной цепью ДНК; эта конструктивная особенность физически ограничивает связывающие домены небольшой областью генома, которая должна содержать обе распознаваемые последовательности, что резко увеличивает специфичность анализов MIP.Кроме того, шумовой сигнал анализа снижается за счет ферментативного разложения нелигированных линейных MIP путем расщепления экзонуклеазой с эффективностью до 99%. MIP были разработаны для обнаружения до 330 000 целей за одну реакцию (Diep et al., 2012). Возможность мультиплексирования MIP была продемонстрирована в различных клинических исследованиях, таких как высокопроизводительный анализ однонуклеотидных полиморфизмов, метилирование ДНК, обнаружение изменений числа копий генома и другие приложения для генотипирования (Hardenbol et al., 2003; Wang et al., 2005; Diep et al., 2012). Однако приложения для диагностики растений все еще ограничены первым отчетом, описывающим успешное обнаружение Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans в инфицированном Arabidopsis thaliana с пределом обнаружения 2,5 нг (Lau et al., 2014). Чтобы повысить эффективность анализов MIP, было разработано программное обеспечение MIPgen для проектирования и прогнозирования производительности отдельных MIP (Boyle E.A. et al., 2014).

Серьезными ограничениями этих анализов являются требование нескольких температурных настроек на протяжении всего анализа и утомительный, но сложный экспериментальный процесс, который делает его непригодным для тестирования POC. Кроме того, анализ занимает много времени и занимает более 10 часов для завершения реакции, что делает тесты MIP подходящими только для приложений в лаборатории. MIP длиной> 100 п.н. требуют очистки ВЭЖХ, что увеличивает стоимость синтеза олигонуклеотидов. Достижение высокого уровня мультиплексного обнаружения с участием тысяч MIP за одну реакцию требует больших начальных инвестиций.Кроме того, мультиплексное обнаружение с использованием анализов MIP требует сложной платформы считывания, такой как секвенирование следующего поколения, микроматрицы или биосенсоры (Lin et al., 2010; Wang et al., 2012; Carrascosa et al., 2014), что еще больше увеличивает стоимость анализа.

Недавно опубликованный метод, использующий комбинацию RPA и поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния (SERS), описал возможность множественного обнаружения патогенов растений в полевых условиях (Lau et al., 2016). Рамановское рассеяние с усилением поверхности (SERS) — это метод, который обеспечивает улучшенные картины комбинационного рассеяния адсорбированных молекул на поверхности металлических наночастиц при однократном лазерном возбуждении (Schlucker, 2014).Сообщается, что SERS является потенциально мощным инструментом обнаружения с помощью молекулярной спектроскопии (Московиц, 2010) и очень многообещающей технологией считывания данных для быстрых диагностических тестов (Anker et al., 2008; Bantz et al., 2011; Sharma et al., 2012) . SERS дает узкие и отчетливые спектральные пики, которые обеспечивают более высокую точность после анализа по сравнению со стандартными флуоресцентными методами для приложений с высокой степенью мультиплексирования (Schlucker, 2009; Wang and Schlucker, 2013; Laing et al., 2016). Кроме того, SERS с использованием различных репортеров комбинационного рассеяния позволил обнаружить мультиплексирование (Lai et al., 2015), особенно в клинических применениях (Maiti et al., 2011; Wang et al., 2015). Первый отчет, включающий SERS с мультиплексным RPA для сельскохозяйственных приложений, появился в 2016 году, обнаружив несколько патогенов растений (Lau et al., 2016). Этот метод был успешно использован для обнаружения Botrytis cinerea на зараженных растениях томатов в полевых условиях. Хотя этот метод готов к применению в полевых условиях, он включает в себя дорогой портативный считыватель SERS, что может ограничить его применение.

Обсуждение и заключение

Основным преимуществом диагностического тестирования POC является получение быстрых результатов in situ , что позволяет фермерам принимать немедленные управленческие решения и минимизировать потери урожая. Дополнительным преимуществом является сокращение логистических проблем, связанных с транспортировкой образцов в централизованные лаборатории для анализа болезней и сопутствующих затрат на рабочую силу. Диагностические комплекты POC должны быть портативными и удобными для пользователя, позволяющими одному оператору без специальных научных навыков проводить тест.В этой статье обсуждались некоторые из широко используемых методов на основе нуклеиновых кислот для обнаружения патогенов растений. Хотя подавляющее большинство текущих приложений основано на ПЦР, многочисленные отчеты об исследованиях показали, что существующие изотермические методы могут работать так же или даже лучше, чем анализы на основе ПЦР. Возможность проводить реакции при постоянной температуре делает изотермические методы многообещающими кандидатами для диагностических тестов в местах оказания медицинской помощи в условиях ограниченных ресурсов. Каждая из изотермических и неизотермических технологий, обсуждаемых здесь, имеет неотъемлемые преимущества и ограничения, поэтому выбор наилучшей технологии будет зависеть от конкретной проблемы; я.е., характер возбудителя, контролируемая культура и технологические возможности страны.

Среди доступных изотермических методов LAMP и RCA являются лучшими кандидатами для приложений на основе гибридизации, потому что повторяющиеся последовательности, присутствующие в продуктах амплификации, способны повысить чувствительность обнаружения (Gusev et al., 2001; Nallur et al., 2001; Hsieh et al. др., 2012). Однако оба метода производят продукты изотермической амплификации различных размеров и поэтому не подходят для приложений, где для идентификации требуется конкретный размер фрагмента ДНК.Изотермические технологии HDA и RPA не требуют стадии тепловой денатурации и, как результат, могут выполняться непосредственно при постоянной температуре, что является большим преимуществом для полевых применений. Тем не менее, HDA и RPA ограничены целями короче 100 и 500 п.н. соответственно. Кроме того, несмотря на чувствительность и специфичность этих изотермических методов, они не обладают высокой степенью мультиплексирования, что ограничивает их применение обнаружением одного или, в лучшем случае, ограниченного числа патогенов в одном анализе.MIP является многообещающим методом для множественного обнаружения патогенов растений, который может обеспечить высокую специфичность, но его применение в полевых условиях весьма ограничено из-за его технической сложности. Развитие технологии RPA-SERS позволяет выполнять мультиплексное обнаружение поля в течение 90 минут при единственной постоянной низкой температуре (37 ° C) с высокой чувствительностью и специфичностью, однако портативные считыватели SERS дороги.

Технологии секвенирования нового поколения (NGS) обладают огромным потенциалом в диагностической сфере, поскольку они могут идентифицировать несколько патогенов в одном анализе без каких-либо предварительных знаний об их природе (Massart et al., 2014; Withers et al., 2016; Ротт и др., 2017). Тем не менее, им по-прежнему необходимо преодолеть ряд ограничений, прежде чем их можно будет использовать для приложений POC. Оборудование NGS довольно сложное, требующее чистой лабораторной среды, а также надежного источника питания. Подготовка проб к анализу довольно сложна и требует нескольких этапов, пипетирования небольших объемов, периодического использования центрифуг и окончательной проверки качества с использованием оборудования для биоанализа. Наконец, текущая стоимость технологий секвенирования NGS в диапазоне сотен или тысяч долларов слишком высока для рутинного диагностического анализа POC, хотя будущие разработки могут сделать их доступными для этого типа приложений.

Таким образом, традиционные лабораторные методы точны, но трудоемки и медленны и, что наиболее важно, требуют высокоспециализированного технического персонала. К сожалению, доступность квалифицированных патологов растений становится проблемой во всем мире (Horsfall and Cowling, 1977). Методы диагностики на основе антител явно быстрее, чем традиционные методы, но специфичность обнаружения иногда может быть сильно нарушена из-за перекрестной реактивности, приводящей к ошибочной идентификации патогена (Franken et al., 1992). Ограничения методов на основе антител еще больше усугубляются их коротким сроком хранения и вариабельностью от партии к партии (Murphy et al., 2012). Методы на основе нуклеиновых кислот обеспечивают более высокую специфичность и могут решить многие проблемы, возникающие при диагностике на основе антител (Ward et al., 2004; Vincelli and Tisserat, 2008; Hindson et al., 2011; Miotke et al., 2014). ПЦР — самый популярный метод идентификации патогенов растений на основе ДНК, но для достижения постоянных изменений температуры, которые имеют решающее значение для работы этой технологии, требуется источник питания, что ограничивает ее пригодность для полевых приложений POC (Markoulatos et al., 2002; Sint et al., 2012). Системы изотермической амплификации могут устранить это ограничение и обеспечить лучшую чувствительность, специфичность, а также возможности в приложениях POC либо сами по себе, либо в сочетании с другими технологиями, такими как методы быстрого считывания для анализа продуктов амплификации ДНК.

Авторские взносы

Все перечисленные авторы внесли существенный, прямой и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее к публикации.

Финансирование

Авторы хотели бы поблагодарить Малазийский институт сельскохозяйственных исследований и разработок (MARDI) за предоставление докторской степени.D. стипендия HYL.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Особая благодарность д-ру Инду Б. Джаганатху из MARDI за редактирование рукописи и полезный обзор. Авторы также выражают признательность доктору Норихиро Томита за разрешение использовать схему LAMP на Рисунке 1.

Список литературы

Агриос, Г. Н. (2005). Патология растений. Амстердам: Elsevier Academic Press.

Google Scholar

Ахмади, С., Алмаси, М. А., Фатехи, Ф., Струик, П. К., и Моради, А. (2013). Визуальное обнаружение вируса скручивания листьев картофеля путем одностадийной изотермической амплификации ДНК, опосредованной петлей обратной транскрипции, с красителем гидроксинафтоловый синий. J. Phytopathol. 161, 120–124. DOI: 10.1111 / jph.12037

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Айл, Дж.А., Малуф, Н. К., Ломан, Т. М. (1999). Для оптимальной активности геликазы требуется олигомерная форма E-coli UvrD. J. Mol. Биол. 293, 815–834. DOI: 10.1006 / jmbi.1999.3185

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альварес, А. М. (2004). Комплексные подходы к обнаружению патогенных бактерий растений и диагностике бактериальных заболеваний. Annu. Преподобный Phytopathol. 42, 339–366. DOI: 10.1146 / annurev.phyto.42.040803.140329

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ан, Л.X., Тан У., Раналли Т. А., Ким Х. Дж., Витиаз Дж. И Конг Х. М. (2005). Характеристика термостабильной геликазы UvrD и ее участие в хеликазозависимой амплификации. J. Biol. Chem. 280, 28952–28958. DOI: 10.1074 / jbc.M503096200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Анкер, Дж. Н., Холл, У. П., Ляндрес, О., Шах, Н. К., Чжао, Дж., И Ван Дайн, Р. П. (2008). Биосенсор с плазмонными наносенсорами. Nat. Mater. 7, 442–453.DOI: 10.1038 / nmat2162

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арауджо Р., Аморим А. и Гусмао Л. (2012). Разнообразие и специфичность микросателлитов в секции Aspergillus Fumigati. BMC Microbiol. 12: 154. DOI: 10.1186 / 1471-2180-12-154

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Артюшин, С., Тонг, Ю. Х., Тимони, Дж., Лемье, Б., Шлегель, А., и Конг, Х. М. (2011). Термофильная геликазозависимая амплификация ДНК с использованием экспериментального набора IsoAmp ™ SE для быстрого обнаружения Streptococcus equi подвидов equi в клинических образцах. J. Vet. Диаг. Вкладывать деньги. 23, 909–914. DOI: 10.1177 / 1040638711416968

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейли А. М., Митчелл Д. Дж., Манджунат К. Л., Ноласко Г. и Ниблетт К. Л. (2002). Идентификация на видовом уровне патогенов растений Phytophthora и Pythium с использованием уникальных последовательностей области ITS1 рибосомной ДНК в качестве зондов захвата для ПЦР-ELISA. FEMS Microbiol. Lett. 207, 153–158. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.2002.tb11044.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Банер, Дж., Нильссон, М., Мендель-Хартвиг, М., и Ландегрен, У. (1998). Усиление сигнала датчиков висячих замков путем воспроизведения по катящемуся кругу. Nucleic Acids Res. 26, 5073–5078. DOI: 10.1093 / nar / 26.22.5073

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Банц, К. К., Мейер, А. Ф., Виттенберг, Н. Дж., Им, Х., Куртулус, О., Ли, С. Х. и др. (2011). Недавний прогресс в области биосенсинга SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 11551–11567. DOI: 10.1039 / c0cp01841d

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бхат А.И., Силджо А. и Дишма К.П. (2013). Быстрое обнаружение вируса желтой крапчатости Piper и вируса мозаики огурца , заражающего черный перец ( Piper nigrum ), с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей (LAMP). J. Virol. Методы 193, 190–196. DOI: 10.1016 / j.jviromet.2013.06.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бланко, Л., Бернад, А., Лазаро, Дж. М., Мартин, Г., Гармендиа, К., и Салас, М. (1989). Высокоэффективный ДНК-синтез ДНК-полимеразой фага Phi-29 — симметричный режим репликации ДНК. J. Biol. Chem. 264, 8935–8940.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Борроу Р., Гивер М., Сэдлер Ф., Качмарски Э. Б. и Фокс А. Дж. (1998). Ложноположительный диагноз менингококковой инфекции с помощью IS1106 PCR ELISA. FEMS Microbiol. Lett. 162, 215–218. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.1998.tb13001.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бойл, Д. С., Макнерни, Р., Лоу, Х. Т., Лидер, Б. Т., Перес-Осорио, А. К., Мейер, Дж. С. и др. (2014). Быстрое обнаружение Mycobacterium tuberculosis путем амплификации рекомбиназной полимеразы. PLOS ONE 9: e103091. DOI: 10.1371 / journal.pone.0103091

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бойл, Э.А., О’роак, Б.Дж., Мартин, Б.К., Кумар, А.и Шендуре Дж. (2014). MIPgen: оптимизированное моделирование и дизайн зондов молекулярной инверсии для целевого повторного секвенирования. Биоинформатика 30, 2670–2672. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btu353

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бразилейро, Б. Т. Р. В., Коимбра, М. Р. М., Де Мораис, М. А., и Де Оливейра, Н. Т. (2004). Генетическая изменчивость внутри вида Fusarium solani, выявленная с помощью ПЦР-фингерпринта на основе маркеров ПЦР. Braz. J. Microbiol. 35, 205–210. DOI: 10.1590 / S1517-83822004000200006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карраско-Бальестерос, С., Кастильо, П., Адамс, Б. Дж., И Перес-Артес, Э. (2007). Идентификация Pratylenchus thornei , нематоды, поражающей корни злаковых и бобовых культур, на основе SCAR-PCR и сателлитной ДНК. Eur. J. Plant Pathol. 118, 115–125. DOI: 10.1007 / s10658-007-9110-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карраскоса, Л.Г., Ибн Сина, А., Паланисами, Р., Сепульведа, Б., Отте, М. А., Рауф, С. и др. (2014). SPR-биосенсинг на основе зондов с молекулярной инверсией для специфического, безметочного обнаружения регионального метилирования ДНК в реальном времени. Chem. Commun. 50, 3585–3588. DOI: 10.1039 / c3cc49607d

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Charlermroj, R., Himananto, O., Seepiban, C., Kumpoosiri, M., Warin, N., Oplatowska, M., et al. (2013). Мультиплексное обнаружение патогенов растений с помощью микросферной иммуноанализа. PLOS ONE 8: e62344. DOI: 10.1371 / journal.pone.0062344

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, X. Y., Ван, X. F., Jin, N., Zhou, Y., Huang, S. A., Miao, Q. M., et al. (2012). Конечная точка визуального обнаружения трех генетически модифицированных рисовых растений с помощью петлевой изотермической амплификации. Внутр. J. Mol. Sci. 13, 14421–14433. DOI: 10.3390 / ijms131114421

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чау, В.Х. А., Макклоски, К., Тонг, Ю. Х., Ху, Л., Ю, К. М., Келли, С. П. и др. (2008). Применение изотермической геликазо-зависимой амплификации с одноразовым устройством обнаружения в простом чувствительном тесте стула на токсигенный Clostridium difficile. J. Mol. Диаг. 10, 452–458. DOI: 10.2353 / jmoldx.2008.080008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Комсток, Дж. К. (1992). Обнаружение возбудителя ожогов листьев сахарного тростника, Xanthomonas-Albilineans, с использованием иммуноанализа тканевым блоттингом, ELISA и методов выделения. Завод Dis. 76, 1033–1035. DOI: 10.1094 / PD-76-1033

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Корона, Ф. М. О., Ариф, М., Кааси, Д., и Дэниелс, Дж. (2010). Применение зависимой от геликазы амплификации, 5’-некомплементарных A / T-богатых последовательностей и оптимальной термодинамики во время конструирования праймеров для увеличения детекции изотермической ПЦР. конф. Int. Орган. Citrus Virul. 18, 70.

Краннелл, З.А., Рорман, Б., и Ричардс-Кортум, Р. (2014).Количественное определение ДНК ВИЧ-1 с использованием амплификации рекомбиназной полимеразы в реальном времени. Анал. Chem. 86, 5615–5619. DOI: 10.1021 / ac5011298

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кроу П. и Балакандран В. (2012). Технологии изотермической амплификации нуклеиновых кислот для диагностики на месте: критический обзор. Лабораторный чип 12, 2469–2486. DOI: 10.1039 / c2lc40100b

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дай, Дж., Пэн, Х., Чен, В., Ченг, Дж., И Ву, Ю. (2013). Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для одновременного обнаружения трех вирусов Потивируса i

Методы диагностики глазных инфекций — от культуры микроорганизмов до молекулярных методов

1. Введение

1.1. Обычные методы микробиологической диагностики: посев, выделение и фенотипическая идентификация

Несмотря на достижения в области медицины, 4 из 10 ведущих причин смерти во всем мире связаны с инфекционными заболеваниями [1].Инфекции глаз являются одними из наиболее распространенных заболеваний, и первым возбудителем являются бактерии, за которыми следуют грибок и вирус. Среди этих бактерий рода Staphylococcus, , рода Streptococcus, Corinebacterium sp, Chlamydia sp, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus sp, Serratia sp часто встречаются при кератите, конъюнктивите, эндофтальмите [2] и корнеофтальмите [2]; Fusarium sp, Aspergillus sp и Candida sp, — обычно грибки, обнаруживаемые при инфекциях кератита [3]; Аденовирус, ВПГ-1 (вирус простого герпеса-1), ВПГ-2 (вирус простого герпеса-2), VZV (вирус ветряной оспы), ВПЧ (вирус папилломы человека) важны при конъюнктивите и кератите [4].

Для уменьшения осложнений от глазных инфекционных заболеваний очень важно обеспечить соответствующее раннее лечение. Чтобы это стало возможным, необходима микробиологическая идентификация возбудителя инфекции в кратчайшие сроки. Тем не менее, микробиологическая диагностика с помощью традиционных методов, считающихся золотыми стандартами, на основе культуры с последующей фенотипической идентификацией микроорганизма после выделения, проводимая в период от 48 до 72 часов, в зависимости от потребностей микроорганизма, а в случае грибковых инфекций, определение и получение профиля восприимчивости к противогрибковым препаратам займет больше недели.Время идентификации можно сократить за счет использования автоматизированного оборудования, основы которого аналогичны базам, используемым для ручной идентификации, с помощью биохимического профиля микроорганизмов. Эти тесты основаны на способности ферментировать, окислять, разлагать или гидролизовать различные субстраты или расти на разных источниках углерода, вызывая изменения pH, которые можно контролировать с помощью соединений, меняющих цвет в зависимости от pH. Автоматизированные системы работают с карточками, содержащими обезвоженные питательные среды с подходящими субстратами.Время культивирования истекает, пока карты автоматически считываются и данные собираются системой, а данные, собранные в базе данных, идентифицируются посредством идентификации микроорганизмов. Среди доступных автоматизированных систем идентификации — VITEK 2 (bioMérieux, Франция) и BD Phoenix (США), эти системы сокращают время идентификации до 6-12 часов.

Хотя основным недостатком является время, необходимое для идентификации, культивирование позволяет обнаруживать новые или атипичные штаммы, сохранять штаммы для дальнейшей характеристики и напрямую определять чувствительность к антимикробным препаратам [5].

Учитывая срочность, с которой требуется идентификация микроорганизмов, были разработаны другие стратегии, которые еще больше сокращают периоды времени. К ним относятся идентификация с помощью ПЦР по конечной точке, ПЦР в реальном времени, микрочипов и масс-спектрометрии, направленной на обнаружение белков или нуклеиновых кислот.

1.1.1. Конечная ПЦР и ПЦР в реальном времени

Хотя идентификация микроорганизмов посредством культивирования является золотым стандартом, эта методология представляет некоторые сложности, которые решаются с помощью методов молекулярной биологии, таких как ПЦР по конечной точке и ПЦР в реальном времени, что значительно сокращает результат в несколько дней до нескольких дней. часов.Идентификация микроорганизмов с использованием традиционной микробиологии ограничивается медленно растущими или мал жизнеспособными организмами, помимо получения ложноотрицательных результатов из-за лечения пациентов с предварительным отбором антимикробных препаратов [5]. Для идентификации путем культивирования необходимы чистые колонии, поскольку в смесях микроорганизмов невозможно идентифицировать компоненты смеси. Все эти ограничения решаются методом ПЦР. Использование ПЦР в реальном времени возможно для обнаружения нескольких микроорганизмов в одном анализе [6].Для этого требуется сборка множественных реакций, в которых обнаружение микроорганизмов проводится в конце амплификации, когда при повышении температуры постепенно строят кривую диссоциации (кривую плавления). Таким образом, если мы знаем температуру, до которой нити ДНК ампликонов отделяются от каждого микроорганизма, то можно идентифицировать присутствующие в образце микроорганизмы [6,7].

Некоторые из ограничений идентификации с помощью ПЦР заключаются в том, что эта реакция требует использования определенных олигонуклеотидов для каждого микроорганизма, затем каждая реакция ПЦР выполняется для одного или определенной группы подозреваемых организмов.Дизайн конкретных олигонуклеотидов требует знания генома микроорганизма, а также вариантов геномики, иногда новые штаммы или мутации приводят к тому, что олигонуклеотиды, предназначенные для идентификации, могут неправильно выравниваться. Из-за чувствительности теста можно обнаружить даже одну копию целевой последовательности [6], так что загрязнение является одной из основных проблем, одной из причин этого является неадекватные способы взятия образцов и наличие микроорганизмов из нормальной флоры. ложные срабатывания [5].

Даже с учетом упомянутых недостатков, существуют причины, оправдывающие использование ПЦР для диагностики глазных инфекций, из-за важности получения своевременного лечения для остановки инфекционного процесса, поскольку в противном случае нарушаются функции глаза. Глазные инфекции, вызванные грибками, имеют больше преимуществ при обнаружении с помощью ПЦР, потому что рост грибов происходит очень медленно, а обнаружение молекулярными методами происходит очень быстро, что позволяет назначать специфическое лечение [8].

Чувствительность посева при эндофтальмите составляет менее 70%, а при кератите не более 80% из-за небольшого количества инокулята [8]. Если у вас есть образец, который выявит присутствие грибковых культур, процедура и идентификация могут занять более недели с задержкой в ​​лечении. Таким образом, ПЦР на грибки обеспечивает чувствительность, необходимую в случае плохой пробы, даже в день ее получения [8]. В настоящее время очень мало клинических диагностических наборов для ПЦР. Компания Roche предоставляет наборы для обнаружения Chlamydia trachomatis , CMV, EBV, гепатитов A, B и C, HSV 1 и 2, VZV, ВИЧ и Neisseria gonorrhoeae , в то время как Bio-Rad предлагает наборы только для Chlamydia trachomatis и Mycoplasma. .Ни одна компания не предлагает несколько испытаний или генериков, которые могут обнаружить присутствие грибков и / или бактерий. Общее обнаружение бактерий выполняется с использованием олигонуклеотидов, предназначенных для связывания с консервативной областью гена рибосомной РНК 16S, тогда как для обнаружения грибов мишенью является ген 18S. Несмотря на то, что для соответствующего лечения важно знать личность организма, различение бактерий или грибов как возбудителей инфекции позволяет ввести общее лечение, поскольку проводится ранняя идентификация микроорганизма.Отсутствие коммерческих наборов для тестирования позволяет диагностическим лабораториям использовать «домашние» методы конечной ПЦР и ПЦР в реальном времени, разработанные и проверенные ими самими [8].

1.1.2. Идентификация путем полного секвенирования генома

Время, затрачиваемое на секвенирование генома, уменьшилось. Первое секвенирование генома в 1995 г. (Haemophilus influenzae , ) заняло более года [9], тогда как сегодня технологии позволяют секвенировать в сотни тысяч раз быстрее. В настоящее время в базе данных GenBank хранится информация о 3144 полных геномах [10].Вся эта информация позволяет реализовать методы идентификации на основе секвенирования. Посредством сравнения последовательностей, полученных при анализе клинических образцов, с последовательностями, содержащимися в базах данных, микробиологическая идентификация с высокой достоверностью занимает всего несколько часов. Эти новые технологии используют ПЦР для амплификации ДНК в сочетании с системой параллельного секвенирования с использованием таких методов, как пиросеквенирование, секвенирование путем лигирования и секвенирование путем синтеза.

Хотя эта технология доступна на платформах Roche 454, платформа SOLID от Life Technologies и платформа Illumina, плюс затраты на технологию, интерпретация результатов, возможно, является самым большим препятствием для внедрения секвенирования генома в качестве рутинного метода идентификации в клинических лабораториях. [10].

В 2005 г. Yeo et al., сообщили о вспышке острого геморрагического конъюнктивита в Сингапуре [11]. Пациентам был поставлен клинический диагноз «острый геморрагический конъюнктивит», с помощью ПЦР было определено наличие энтеровируса, а молекулярное типирование подтвердило вариант вируса Коксаки А24 (CA24v). Результаты секвенирования полноразмерного генома показали, что причиной вспышки был вирус CA24v, который произошел от вируса, появившегося 40 лет назад.

1.1.3. ПЦР в сочетании с масс-спектрометрией с использованием ионизации электрораспылением (ПЦР / ESI-MS)

Для идентификации с помощью ПЦР / ESI-MS с использованием олигонуклеотидов, специфичных для групп бактерий, а не для конкретного вида, хотя вариабельные области амплифицируются между видами и штаммами.Кроме того, существуют видоспецифичные олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров, нацеленных на гены устойчивости к антибиотикам или некоторых патогенных характеристик [12]. После амплификации ампликоны подвергаются масс-спектрометрии, и полученная картина сравнивается с данными в базах данных. Возможность идентифицировать организм без предварительного знания грамма или группы микроорганизмов является еще одним преимуществом [12], поскольку не требуются окрашивания или предыдущие изоляты, что обеспечивает быстрое испытание и всегда позволяет идентифицировать микроорганизмы.Эта технология улучшит идентификацию микроорганизмов при глазных инфекциях, она имеет некоторые преимущества, такие как определенность и специфичность, но, тем не менее, стоимость является основным недостатком.

Kaleta et al., разработали исследование для оценки возможности использования ПЦР / ESI-MS для идентификации микроорганизмов непосредственно из бутылей для культур крови в лаборатории клинической микробиологии [12]. Высокое соответствие результатов этого метода с результатами стандартных методов, особенно на уровне рода, демонстрирует, что метод ПЦР / ESI-MS способен быстро оценивать клинически сложные образцы, предоставляя информацию о выборе и введении целевых антибиотиков.

Что касается глазных микроорганизмов, Pedreira et al., оценили эффективность профилактического режима ежедневного местного применения 0,5% моксифлоксацина и 5% повидон-йода у пациентов с Бостонским типом I. У пациентов с профилактическим режимом были взяты образцы и проанализированы стандартные методы культивирования и ПЦР / ESI-MS [13]. Подход молекулярной диагностики с использованием ПЦР / ESI-MS дал данные, сопоставимые с данными, полученными с использованием стандартных микробиологических методов. Из-за высокой пропускной способности и быстрых результатов этот метод может быть полезным инструментом наблюдения за пациентами с Бостонским типом I.

2. Микроматрицы

Как мы описали ранее, ПЦР имеет несколько преимуществ перед культивированием для выявления микроорганизмов, инфицированных. Однако отсутствие возможности работать с разными геномами одновременно и получение продукта с одинаковым размером молекул делают ПЦР не лучшим методом диагностики. Поэтому были разработаны новые методы диагностики, которые не только сокращают время процесса; также они обладают большей чувствительностью и специфичностью [14].

Это случай микрочипов ДНК, также называемых биочипом, ДНК-чипом или массивом генов, которые определяются как упорядоченное расположение образцов генов для сопоставления известных и неизвестных образцов ДНК на основе правил спаривания оснований и автоматизации процесса идентифицируя неизвестные, и они были созданы Брауном П.О. и Ботштейн Д. в 1999 году. Эксперимент с одним чипом ДНК может предоставить исследователям информацию о тысячах генов одновременно, что значительно повысит производительность. Технология на основе микрочипов, обладающая преимуществом высокой степени параллелизма, применялась как для профилирования популяций, так и для функциональных исследований сложных микробных сообществ в окружающей среде [15, 16]. Кроме того, в нескольких исследованиях сообщалось об использовании ПЦР-амплифицированных последовательностей геномных фрагментов в качестве зондов.

Массивы генов можно классифицировать как макромассивы или микромассивы, в зависимости от размера пятен образца.Макроматрицы содержат пятна образца размером около 300 микрон или больше и могут быть легко визуализированы с помощью существующих гелевых и блот-сканеров. Размеры пятен пробы в микроматрице обычно меньше 200 микрон в диаметре, и эти матрицы обычно содержат тысячи пятен; микрочипы требуют специальной робототехники и оборудования для обработки изображений.

Существует несколько этапов разработки и реализации эксперимента с ДНК-микрочипом, как показано на рисунке 1.

Рисунок 1.

Разработка и реализация эксперимента с ДНК-микрочипом

Важно отметить, что микроматрицы, сделанные с кДНК называются массивами пятен, потому что зонды создаются in vitro, и робот помещает пятна на микропланшет.Вместо микрочипов с олигонуклеотидами создается in situ, [17]. В недавних исследованиях в качестве зондов использовались синтезированные олигонуклеотиды из-за их гибкости в дизайне и получении; с интенсивной оценкой специфичности, применяемой к критериям дизайна зонда [18].

И макроматрицы, и микроматрицы могут иметь две формы применения для технологии микрочипов ДНК: идентификация последовательности (гена / мутация гена) и определение уровня экспрессии генов.

Определение уровня экспрессии генов с помощью микрочипов можно изучить транскриптомом или протеомом. Для микрочипов транскриптома зонды состоят из кДНК, которая гибридизуется с мРНК клетки. С другой стороны, протеомные микроматрицы могут использовать белки в качестве зонда или антитела, вызывающего реакцию антиген-антитело. Одним из примеров этого микроматрицы является анализ пептидных микрочипов in silico -предсказанных эпитопов для серологической диагностики инфекции Toxoplasma gondii у людей [19].

Что касается идентификации последовательности гена, микроматрица должна содержать геномную ДНК в качестве зонда конкретной хромосомы, в частности, всех генов, составляющих хромосому. Или, когда микроматрица имеет только ген с одним или несколькими разными нуклеотидами, называемый однонуклеотидным полиморфизмом (SNP), можно обнаружить мутацию гена [20].

Эти микроматрицы используются для определения прогрессирования рака; все изменения в этих генах важны для установления клинического прогноза [20]. Такие микроматрицы использовались для обнаружения конкретных бактерий [22, 23], определения видов [24] и скрининга экологических последовательностей, связанных с определенной функцией внутри сообщества [25, 26].

Chin-I, et al., , связанная с технологией ПЦР 16S рДНК и ДНК-гибридизации для создания микроматрицы для одновременного обнаружения и распознавания восьми патогенов рыб ( Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Flavobacterium columnare, Lactococcus garvieselas, Photobacterium anguilliseptica, Streptococcus iniae и Vibrio anguillarum ), обычно встречающиеся в аквакультуре. Набор включал короткие олигонуклеотидные зонды, комплементарные полиморфным областям генов 16S рРНК целевых патогенов.Результаты показали, что каждый зонд последовательно идентифицировал соответствующий целевой штамм со 100% специфичностью [27].

Yu-Cheng et al., разработали ДНК-зонды и праймеры для ПЦР для обнаружения Listeria monocytogens, Staphylococcus aureus, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli O157: H7 , Salmonella spp. и Pseudomonas fluorescens с использованием двух наборов мультиплексной ПЦР с последующей системой хромогенного макроматрицы, эти организмы в молоке или других пищевых продуктах могут быть обнаружены одновременно [28].

Примером микрочипа, разработанного для диагностики инфекций, является микроматрица, разработанная Uchida et al., для прямого обнаружения патогенов при костно-суставных инфекциях с помощью амплификации полимеразной цепной реакции и гибридизации микроматрицы [29].

И, наконец, наиболее интересным ДНК-микрочипом, используемым для диагностики эндофтальмита, является микрочип, разработанный Tsutomu et al. Они использовали 13 образцов стекловидного тела (ФЖ), полученных от 13 пациентов во время витрэктомии.Стекловидные жидкости трех пациентов с подозрением на эндофтальмит и десяти контрольных пациентов без инфекции были подвергнуты тестированию на присутствие бактерий и грибков в тестах на культуру, анализе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализе ДНК-микрочипов. Микроматрица ДНК содержала пятна для 16S рДНК, вариабельные и консервативные области для бактерий и 18S рДНК для грибов. Ни один контрольный образец не был положительным на бактерии или грибки в тесте на культуру, ПЦР или анализе микрочипов. Образцы от двух пациентов (случаи 1 и 2) с подозрением на эндофтальмит были положительными на бактерии в ПЦР, а образец от одного пациента (Случай 3) был положительным на грибки при ПЦР. Klebsiella pneumonia (Случай 1), Streptococcus agalactiae (Случай 2) и Candida parapsilosis (Случай 3) в ПЦР-положительных образцах были идентифицированы с помощью анализа микрочипов ДНК в течение 24 часов. Результаты культивирования также были положительными для K. pneumonia в случае 1, S. agalactiae в случае 2 и C. parapsilosis в случае 3, но для получения потребовалось от 3 до 4 дней [30].

Для диагностики инфекций микроматричный анализ дополняет рутинные посевы для выявления возбудителей болезней и, вероятно, будет полезным инструментом для пациентов, которым требуется быстрая диагностика и раннее лечение.

3. Аптамеры

Термин «аптамеры» происходит от латинского aptus , что означает адаптироваться [31]. Аптамеры — это синтетические нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), которые специфически связываются с широким спектром молекул, включая ионы металлов K ²⁺ , Hg ²⁺ , Pb ²⁺ , АТФ, антибиотики, аминокислоты, витамины, органические вещества. красители, пептиды и белки, а также аптамеры не иммуногенны и нетоксичны, превосходят антитела [32, 33, 34, 35]. Тридцать и 60 нуклеотидов обычно составляют длину центральной области, так что общая длина аптамера составляет от 70 до 100 нуклеотидов.Для отбора аптамеров с более высоким сродством используется метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). При этом молекулы-мишени инкубируются с популяцией аптамеров, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью по аффинности, невзаимодействующие молекулы-мишени удаляются, а олигонуклеотиды амплифицируются с помощью ПЦР и характеризуются секвенированием, позволяя поддерживать запас путем его введения в бактерии с помощью плазмид. После получения индивидуальных аптамеров было охарактеризовано их взаимодействие с молекулой-мишенью такими методами, как SPR, ELISA, вестерн-блоттинг или слот-блот [36].

3.1. Приложения аптамеры

Аптамеры могут быть использованы в различных областях исследований; некоторые из его приложений рассмотрены ниже.

Биотехнология: аптамеры могут использоваться для очистки белков [37], а также для разработки таких методов, как вестерн-блоттинг или иммунопреципитация хроматина [38], а также для мониторинга статуса фосфорилирования белков in vivo [35]. Существует аптамер с активностью ингибитора фактора свертывания крови IXa путем добавления антисмысловой РНК, это важный метод контроля кровотечения у пациентов с непереносимостью гепарина, аптамер представляет интерес для лечения и диагностики [40].

Терапия: терапевтические мишени можно разделить на два класса: внутриклеточные мишени, такие как факторы транскрипции, и внеклеточные мишени, такие как вирусы. Аптамеры можно вводить внутривенно или подкожно; существует также местное применение для предотвращения взаимодействия патогенов со своими рецепторами на поверхности слизистой оболочки. Высвобождение интрацеллюлараптамеров для связывания их мишеней происходит в основном за счет включения в липосомы или систем вирусной экспрессии.Методика с использованием липосом для высвобождения ДНК фузигеникаптамера вирусного вектора в клетках-мишенях показала секвестрацию E2F (фактора транскрипции), приводящую к снижению роста аномальной сосудистой ткани, что обычно наблюдается после ангиопластики [41]. Некоторые исследовательские группы изучали экспрессию аптамеров в клетках. Примером этого является экспрессия последовательности, инициирующей химерный транскрипт, состоящей из тРНК-Met человека и псевдокнотаптамера обратной транскриптазы против ВИЧ под контролем промотора РНК-полимеразы III в клетках человека 293.Химерная РНК привела к снижению репликации вируса более чем на 75%, аналогичные результаты наблюдались при проведении трансфекции в клетках Jurkat [41]. FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) одобрило систему Eyetech / Pfizer’s aptamer (Macugen) для лечения связанной с ней дегенерации желтого пятна. Мишенью Macugen является VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), предотвращающий неоваскуляризацию хориоидеи [43, 44]. Существуют аптамеры против амилоидогенных белков, таких как пептид Aß, ассоциированного с болезнью Альцгеймера [45], и против аномальных белков при прионных заболеваниях, скрепи и болезни Крейтцфельда-Якоба [46, 47].

3.2. Диагностика и биосенсоры

Высокое сродство и специфичность аптамеров делают их идеальными реагентами для диагностики. А также аптамеры могут быть обнаружены с помощью дифференциальной флуоресценции окрашивания, что обеспечивает высокую чувствительность. Существуют аптамеры, называемые «маяками», которые имеют множество применений, начиная от обнаружения загрязнителей окружающей среды и, таким образом, также для мониторинга уровней канцерогенов или лекарств в крови [48]. Разработка аптамеров с квантовыми точками также может помочь установить роль аптамеров как биосенсоров [49, 50].Квантовые точки — это новые флуорофоры с другим профилем излучения, но все они возбуждаются на одной длине волны. В этой системе несколько копий аптамера прикреплены к одной квантовой точке, и каждое основание аптамера связывается с комплементарной цепью. Пробка перемещается при связывании лиганда, что приводит к значительному увеличению эмиссии флуоресценции. Если разные аптамеры иммобилизованы каждый на одной квантовой точке, несколько лигандов могут быть обнаружены в одном анализе. Аптамеры обладают большим потенциалом в качестве систем раннего предупреждения для обнаружения связывания клеточной поверхности с поврежденными или больными клетками.

3.3. Аптамеры: подход к диагностической микробиологии

Ранее рассматривались различные подходы к применению аптамеров. Использование аптамеров в микробиологии интересно, так как есть новые инструменты для диагностики инфекций. Сегодня несколько исследовательских групп занимаются разработкой аптамеров, направленных на обнаружение микроорганизмов. Duan et al., посредством системной эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) разработали ДНК-аптамер, меченный карбоксифлуоресцеином (FAM), который специфически связывается с Vibrio parahaemolyticus [51]; Zelada et al., с помощью потенциометрических биосенсоров аптамерной системы на основе углеродных нанотрубок, прикрепленных к одинарной стенке (SWCNT), были способны идентифицировать и детектировать Escherichia coli с линейным ответом [52]. Аптамеры представляют собой очень гибкий метод обнаружения микроорганизмов, например, в случае определения E. coli на основе иммуномагнитного разделения и ПЦР-аптамеров в реальном времени, этот метод состоит из трех этапов, сначала связывание E. coli к антителу, конъюгированному с магнитной бусиной, второй аптамер РНК захватывается на поверхности E.coli , формируя сэндвич, а затем в результате теплового процесса высвобождают аптамеры, которые усиливаются с помощью ПЦР в реальном времени. Чувствительность метода позволила выявить 10 E. coli в 1 мл образца [53]. Аптамеры также были разработаны для анализа флуоресценции квантовых точек против Bacillus thuringiensis , обнаруживая до 1000 КОЕ / мл [54]. Необходимо проанализировать применение аптамеров в микробиологической диагностике и преимущества перед другими диагностическими методами; однако информации о применении аптамеров в микробиологической области мало.

3.4. SOMAmers

SOMAmers (Slow-Off-Rate Modified Aptamers) представляют собой аптамеры одноцепочечного типа дезоксинуклеотидов, выбранные in vitro из больших случайных библиотек за их способность связывать небольшие молекулы, пептиды или белки [55, 56]. SOMAmers — аптамеры, несущие остатки dU в положении 5, которые участвуют во взаимодействиях с молекулами-мишенями [57].

SOMAmers были созданы для более чем 1000 белковых мишеней с различными молекулярными функциями, включая известные заболевания и физиологические ассоциации.Целевые семейства в целом включают рецепторы, киназы, факторы роста и гормоны, а также включают разнообразный набор внутриклеточных и внеклеточных белков.

Ядро реагентов представляет собой SOMAmer, связанный с биотином через фотоотщепляемый линкер, позволяющий связываться со стрептавидином комплекса на этапах промывки (рис. 2). Флуорофор Cy3, включенный в реагенты для захвата, позволяет количественно определять белок, доступный коммерчески доступным системам на основе систем микроматриц, но не является необходимым для всех форматов анализа (SomaLogic ®).

Патенты на диагностические методы

: — Скачать PDF

бесплатно

1 Основы патентного права на диагностический метод. Патенты после Майо Дуэйн К. Маркс, патентный поверенный Roche Diagnostics Operations, Inc.

2 Почему это важно? ЛЮДИ! Пациенты получают пользу от диагностики: 70% медицинских решений врачей полагаются на результаты диагностических исследований * у каждой восьмой женщины разовьется рак груди; 1 из 36 умрет ** Пациенты получают пользу от сопутствующей диагностики: более быстрое одобрение FDA новых (более эффективных) фармацевтических препаратов. Снижение государственных расходов на лекарственные препараты, когда они неэффективны. Все получают выгоду от рабочих мест: компании по диагностике и близлежащие сообщества, больницы и лаборатории USPTO, финансирование университета FDA * Стив Burrill, Burrill & Co.Венчурный капитал, EMBO Rep. Октябрь 2007 г .; 8 (10): ** Оценки Американского онкологического общества для США по состоянию на 2014 г., 2

3 Основа: краткий обзор Решение суда по делу Мейо должно быть проанализировано с учетом конкретных спорных требований (а не абстрактно). 1. Рассмотрите анализ Суда: в контексте / предварительном тексте, по которому иск был признан недействительным; и ввиду конкретной формулировки претензии, рассматриваемой в деле.2. Примените полезные подсказки, предоставленные судом в деле Мейо. 3. Следуйте за ФРС. Cir. ■ Лидерство в применении Mayo для диагностических заявлений. 3

4 Структура: контекст или предварительный текст решения Мэйо [T] oo широкое толкование этого принципа исключения может скрыть патентное право. Ведь все изобретения на том или ином уровне воплощают, используют, отражают, основываются на или применяют законы природы.(Мэйо, стр. 2) [Любое применение закона природы к известной структуре или процессу вполне может заслуживать патентной защиты. (Мэйо, стр. 2) Наш вывод основывается на рассмотрении рассматриваемых нами конкретных требований в свете прецедентов Суда. [которые] предостерегают нас от защиты патентов, заявляющих о процессах, которые слишком широко препятствуют использованию естественного закона. (Мэйо, стр.3). [Мы] е [не] отклоняемся [] от установленных общих правовых норм, чтобы новые правила защиты [для] одного поля не привели к непредвиденным результатам в другом.(Мэйо, стр.24). 4

5 Структура: Администрирование на конкретном языке утверждений: просто относится к соответствующей аудитории. попытка [ы] ограничить использование формулы определенной технологической областью. проинформируйте [ы] соответствующую аудиторию [о законе природы]. выберите соответствующую аудиторию. ограничить абстрактную идею одной областью использования. выбирает группу, заинтересованную в применении закона природы.= Область применения: M.P.E.P (не накладывает фактических границ в рамках притязаний) 5

6 Структура: определение конкретного языка заявления: [используйте] любой процесс, который пожелает врач. измерить (каким-то образом) текущий уровень метаболита. обычные шаги, описанные на высоком уровне общности, изложенные в очень общем языке, охватывающие все процессы, использующие [закон природы], включая обнаруженные позднее процессы, которые измеряют уровни метаболитов по-новому.можно было бы удовлетворить без преобразования крови, если бы наука разработала другую систему, не предполагающую преобразований. = Пре-, Пост-решение: M.P.E.P (не налагает значимых ограничений на выполнение шагов заявленного метода; не является центральным для изобретенного метода) 6

7 Основы: особый язык формулы, в котором: не ограничиваются случаями, когда врач фактически [регулирует] уровень дозировки [на основе] результатов теста.сообщить калибровке дозировок тиопуринов. самое большее — предлагает [врач] принять во внимание эти законы. скажите врачам, что они могут сделать вывод в свете корреляций. = Неограничивающий: M.P.E.P (объем формулы не ограничен тем, что пункт, не требующий выполнения шагов или ограничивающий формулу для конкретной конструкции) 7

8 The Framework: Конкретный язык утверждения Претензия в целом: рассматриваемая нами претензия [является] чрезмерно широкой; оно [не] существенно отличается от только что сказанного утверждения о применении [закона природы].не ограничивают свою досягаемость конкретными приложениями [е] закона [природы]. охватить все процессы, использующие корреляции. фактически утверждают, что основной закон природы непропорционально ограничивает использование основных естественных законов, препятствуя их использованию в дальнейших открытиях. чем более абстрактно формулируются требования [процесса], тем труднее точно определить, что они охватывают. = Упреждение: M.P.E.P (заявка не ограничена конкретным практическим применением; излагается только этап области использования и этап действий до и после решения, ни им.

Статистические методы в диагностической медицине, 2-е издание

Перейти к основному содержанию

Корзина0

• КТО МЫ СЛУЖИМ

  • Ученики

    • Аренда учебников

  • Инструкторы

  • Авторы книг

  • Профессионалов

  • Исследователи

  • Учреждения

  • Библиотекарей

  • Корпорации

  • Общества

  • Редакторы журналов

  • Книжные магазины

  • Правительство

• ПРЕДМЕТЫ

  • Бухгалтерский учет

  • сельское хозяйство

    • сельское хозяйство

    • Аквакультура

  • Искусство и архитектура

    • Архитектура

    • Искусство и прикладное искусство

    • Графический дизайн

  • Управление бизнесом

    • Бухгалтерский учет

    • Реклама

    • Управление бизнесом

    • Бизнес и общество

    • Деловая этика

    • Самопомощь в бизнесе

    • Бизнес-статистика и математика

    • Бизнес-технологии

    • Развитие карьеры

    • Консультации

    • Экономика

    • Финансы и инвестиции

    • Интеллектуальная собственность и лицензирование

    • Управление

    • Маркетинговые продажи

    • Некоммерческие организации

    • Производственные операции

    • Управление проектом

    • Недвижимость и недвижимость

    • Государственное управление

    • Управление качеством

    • Малый бизнес

    • Специальные темы

    • Технологии

    • Обучение и развитие персонала

  • Химия

    • Союзная химия здравоохранения

    • Аналитическая химия

    • Аккумуляторы и топливные элементы

    • Биохимия

    • Катализ

    • Химическая и экологическая безопасность

    • Вычислительная химия

    • Электрохимия

    • Экологическая химия

    • Пищевая наука и технологии

    • Общая химия

    • История химии

    • Промышленная химия

    • Неорганическая химия

    • Математика для химии

    • Органическая химия

    • Фармацевтическая химия

    • Физическая химия

    • Подготовительная химия

    • Специальные темы

    • Устойчивая химия

  • Вычисление

    • Компьютерная графика

    • Информационные технологии

    • Оборудование

    • Интернет и WWW

    • Офисная производительность

    • Операционные системы

    • Программная инженерия

    • Специальные темы

  • Кулинария и гостеприимство

    • Бухгалтерский учет

    • Выпечка и кондитерские изделия

    • Напитки

    • Организация питания и мероприятий

    • Готовка

    • Еда, напиток

    • Операции общественного питания

    • Написание еды и справочная информация

    • Общая кулинария и гостеприимство

    • Управление гостиницей

    • Маркетинг

    • Профессиональная кулинария

    • Специальные темы

    • Индустрия путешествий и туризма

    • Вина и спиртные напитки

  • Науки о Земле и космосе

    • науки о Земле

    • Изменение окружающей среды

    • Экологическая экономика и политика

    • Экологическая этика

    • Экологического менеджмента

    • Наука об окружающей среде

    • Экологические исследования

    • География

    • Геология и геофизика

    • Океанография

Диагностика астмы | AAFA.org

Диагноз астмы

Для диагностики астмы ваш врач обсудит с вами вашу историю болезни и проведет медицинский осмотр. Вам может потребоваться функциональный тест легких и, возможно, другие тесты, такие как рентген грудной клетки или пазухи. Если у вас или вашего ребенка регулярно возникают проблемы с дыханием, не ждите! Немедленно обратитесь к врачу. Может помочь знание того, чего ожидать во время диагностического процесса.

Каковы общие способы диагностики астмы?

Личный и медицинский анамнез. Ваш врач задаст вам вопросы, чтобы понять ваши симптомы и их причины. Берите с собой заметки, чтобы улучшить память. Будьте готовы ответить на вопросы о вашей семейной истории, лекарствах, которые вы принимаете, и вашем образе жизни. Это включает любые текущие физические проблемы. Одышка, хрипы, кашель и стеснение в груди могут указывать на астму. Это также включает все предыдущие заболевания. Наличие в анамнезе аллергии или экземы увеличивает вероятность астмы. Семейная история астмы, аллергии или экземы также увеличивает ваши шансы на астму.Сообщите своему врачу о любом воздействии факторов окружающей среды дома или на работе, которые могут усугубить астму. Например, это могут быть перхоть домашних животных, пыльца, пылевые клещи и табачный дым. Врач также может спросить, проявляются ли у вас симптомы со стороны грудной клетки при простуде.

Физический осмотр. Если ваш врач считает, что у вас астма, он проведет медицинский осмотр. Они будут смотреть на ваши уши, глаза, нос, горло, кожу, грудь и легкие. Это обследование может включать проверку функции легких, чтобы определить, насколько хорошо вы выдыхаете воздух из легких.Вам также может потребоваться рентген легких или носовых пазух. После этого медицинский осмотр позволит вашему врачу проверить ваше здоровье.

Функциональные тесты легких. Чтобы подтвердить астму, ваш врач может попросить вас пройти один или несколько дыхательных тестов, известных как тесты функции легких. Эти тесты измеряют ваше дыхание. Функциональные тесты легких часто проводятся до и после вдыхания лекарства, известного как бронходилататор (brahn-ko-DIE-ah-lay-tor), которое открывает ваши дыхательные пути. Если ваша функция легких значительно улучшается при использовании бронходилататора, у вас, вероятно, астма.Ваш врач может также назначить пробу лекарства от астмы, чтобы узнать, помогает ли оно. Общие функциональные тесты легких, используемые для диагностики астмы, включают:

Будут ли они проверять другие условия?

Если ваш врач считает, что у вас что-то другое, кроме астмы или помимо астмы, он может провести другие тесты. Они могут включать рентген грудной клетки, кислотный рефлюкс, рентген носовых пазух или другие специализированные тесты. Ваш врач также может провести тесты на аллергию. Тесты на аллергию не используются для определения наличия астмы.Но если у вас аллергия, они могут быть причиной вашей астмы.

Какие бывают типы астмы?

Существует четыре уровня астмы в зависимости от ее тяжести. От того, насколько часто у вас проявляются симптомы, и от вашей функции легких зависит, насколько серьезно ваша астма. Врач задаст вам вопросы о том, как часто у вас появляются симптомы и как часто вы просыпаетесь ночью от кашля или затрудненного дыхания. Они также могут спросить, как часто у вас возникают проблемы с повседневной деятельностью или с использованием ингалятора для экстренной помощи.

Посмотреть видео на YouTube

Прерывистая астма — у вас симптомы реже двух раз в неделю и вы просыпаетесь менее двух ночей в месяц.
Легкая персистирующая астма — симптомы проявляются два или более дней в неделю, и вы просыпаетесь от трех до четырех ночей в месяц.
Умеренная стойкая астма — симптомы проявляются не реже одного раза в день, и вы просыпаетесь одну или несколько ночей в неделю.
Тяжелая стойкая астма — У вас есть симптомы в течение дня и вы просыпаетесь каждую ночь из-за астмы.

Как диагностируют астму у детей?

Диагностика астмы у детей до 5 лет немного отличается.Детям этого возраста обычно не проводят дыхательный тест. Вместо этого врач спрашивает об определенных признаках и симптомах и назначает бронходилататор, если он думает, что это может быть астма. Если бронходилататор помогает уменьшить симптомы у вашего ребенка, это признак того, что у вашего ребенка может быть астма.

Медицинское обследование, сентябрь 2015 г.

.